用于二恶英类物质生物检测的重组载体和细胞制造技术

本发明专利技术涉及一种重组载体和重组细胞，具体涉及一种用于二恶英类物质生物检测的重组载体以及包含该重组载体的重组细胞。本发明专利技术还涉及所述重组载体和细胞在二恶英类物质生物检测方面的用途。

Recombinant vectors and cells for biological detection of dioxin like substances

The invention relates to a recombinant vector and a recombinant cell, in particular to a recombinant vector for the detection of dioxin like substances and a recombinant cell comprising the recombinant vector. The invention also relates to the use of the recombinant vectors and cells in the detection of dioxin like substances.

【技术实现步骤摘要】
用于二恶英类物质生物检测的重组载体和细胞
本专利技术涉及一种重组载体和重组细胞，具体涉及一种用于二恶英类物质生物检测的重组载体以及包含该重组载体的重组细胞。本专利技术还涉及所述重组载体和细胞在二恶英类物质生物检测方面的用途。
技术介绍
环境污染问题一直伴随着人类社会的发展进程而日益复杂化及多样化，这使得环境污染对人类的健康所带来的负面影响也日益严重。世界卫生组织(WHO)在其《2004年世界卫生报告》中指出在全球范围内估计24％的疾病负担(健康寿命年损失)和23％的所有死亡(早逝)可归因于环境因素，而其中最主要的因素之一就是日益加剧的化学污染物。在众多的化学污染物中，持久性有机污染物(POPs)因为其自身的物化特性和对人类健康的严重威胁受到全球极大的重视。二恶英类化合物(Dioxins)是一类典型的持久性有机污染物，也是斯德哥尔摩公约中首批被列入对人类健康和生态环境有害的持久性有机污染物。国际癌症研究中心已将其列为人类一级致癌物。持久性有机污染物(POPs)具有生物蓄积性、半挥发性和持久性等特点(Vallacketal.,1998；JonesanddeVoogt,1999)。151个国家的政府签署的斯德哥尔摩公约“关于持久性有机污染物”，旨在消除或控制至少12种持久性有机污染物(环境署，2006年)。根据本公约，建立持久性有机污染物的排放清单是强制性的，这为进一步减少排放量奠定基础。因此，在环境中持久性有机污染物监测是重要的第一步(WHO，1999)。其中，持久性有机污染物，多氯二苯并二恶英(PCDDs)、多氯二苯并呋喃(PCDFs)和多氯联苯(PCBs)，即所谓的“二恶英类化合物”，是目前公开的监管和科学关注对象，因为这些化合物具有广泛的毒性效应，包括免疫毒性、发育毒性、生殖毒性、神经毒性和致癌性(Kerkvliet,1995；Brouwer,1991；Nebertetal.,1993)。高分辨率气相色谱/质谱被认为是分析二恶英类物质的黄金标准方法。高分辨液相质谱连用具有灵敏度高、结果准确等优点，但是检测费用相当高昂，并且检测周期长，需要样品量大，使其在环境、食品和卫生等领域开展二恶英类化合物污染状况筛查中的应用受到一定限制。另外，由于化学分析仅限于17种二恶英/呋喃的风险评估，而对其他的有毒多卤代芳香烃化合物(PHAHs)，包括氟化、溴代和混合卤化二恶英/呋喃以及偶氮、氧化偶氮化合物、联苯醚、萘、硫类似物等二氧芑类物质和烷基化的二氧芑类物质则不能指示。此外，化学方法会忽略二恶英类化合物潜在的协同或拮抗作用。在环境中，二恶英类化合物共存的复杂性以及各种同系物的混合物和多级二恶英类化合物之间的相互作用可以调节他们的潜在毒性。大量的研究表明二恶英类化合物和非添加剂之间的相互作用(DavisandSafe,1990；Harperetal.,1995)。因此，化学分析既不高通量监测环境二恶英类化合物也不适合生物毒性的预测，急需要快速而廉价的生物检测方法。为了克服化学分析方法的限制，国际上已经开发出各种生物检测法，主要包括：EROD(ethoxyresorufin-O-deethylas)、ELISA(enzyme-linkedimmunosorbentassay)和CALUX(chemical-activatedluciferaseexpression)。这些生物测定的方法是根据多项研究成果(Nebertetal.,1993；Lucieretal.,1993；Safe,1990；SchmidtandBradfield,1996)。二恶英类化合物的毒性是通过芳香烃受体(AHR)配体依赖的转录因子介导的(Nieetal.,2001)。目前二恶英类化合物结合芳香烃后，芳香烃受体复合物进行变构和AHR核转运蛋白(ARNT)二聚合相互作用。这种异源性的配体复合物(AhR-Arnt)结合到基因启动区的二恶英反应元件(DRE)上，DRE序列的结合导致DNA弯曲、干扰染色质和和核小体，从而激活基因的转录。随后，P4501A1蛋白合成增加并诱导P4501A1酶活性增加，然后产生一系列生物学反应和毒性效应。因此，分析P4501A1依赖的EROD酶活性变化可以指示外源物质的影响。但是，EROD法灵敏度低，限制了其应用范围。ELISA法有很好的特异性，然而该方法不能反映样品的总毒性当量，而且检测过程都需要大量而且昂贵的抗体，增加了检测成本。CALUX法成本低，而且灵敏度高，被认为是最好的生物检测二恶英类物质的生物方法。CALUX方法由美国科学家Denison及其同事在1996年专利技术(MurkA.Jetal.,1996)，该技术已经在多国包括我国获得了多项相关专利。目前，美国、欧盟以及日本已经建立和完善了基于该方法的标准，例如USEPAMethod4435，EUCommissionRegulationNO1883/2006，以及日本的NO.92-1-1。因此，在我国开发二恶英生物检测的CALUX方法迫在眉睫。二恶英类物质可以激发Ah受体(AhR)，这种DNA结合蛋白质接触二恶英类物质时能够产生相应的毒性和生物学反应从而引起化学响应。经过遗传工程处理过的商品化细胞株含有萤火虫荧光素酶基因，通过进入AhR受体激活。这些细胞株可以用于混合物对AhR激发响应的灵敏检测和相对含量确定。这种细胞体外测定法称之为化学响应荧光素酶基因表达或CALUX分析法。能够激发这一体系的化合物主要是多氯代芳烃如2,3,7,8-四氯二苯并二恶英(TCDD)。卤代芳香烃(HAHs)、多环芳香烃(PAHs)、多氯联苯(PCBs)以及一些天然化合物都可以活化该系统，即该系统特异性不够高，所以目前所用的CALUX系统并不能区分检测这些可以激活AhR的化合物，可以通过有效的前处理方法达到区分和检测二恶英类化合物的目的。其他类多氯代芳烃的相对毒性和生物效应可以转化成相对2,3,7,8-TCDD毒性的值来衡量。因为该物质能最强最有效的激活AhR反应，包括基因转录。这种相对定量的方法可以得到总体毒性情况并用毒性当量TEQs来表示。即使用该方法可以得到样品的总毒性当量。目前的问题在于，未来可以通过优化环境样品的前处理方法，提高样品的纯度，进一步提高CALUX系统的特异性。根据二恶英类物质生物检测的现状并结合我国检测设备和水平较落后的具体情况，仍需开发成本低廉、灵敏度高以及克服现有系统缺陷的生物报告检测方法。
技术实现思路
本专利技术的专利技术人经过大量实验，提供了改进的二恶英类化合物生物报告检测载体和细胞，由此完成了本专利技术。本专利技术第一方面涉及重组载体，所述载体沿着其基因转录的方向可操作地连接有来源于CYP1A1启动子的CYP1A1启动子基本区段和两个或多个二恶英反应元件(DRE)富集区段，以及报告基因；所述CYP1A1启动子基本区段和两个或多个二恶英反应元件富集区段调节该报告基因的转录。根据本专利技术第一方面任一项的重组载体，其中所述的CYP1A1启动子为哺乳动物CYP1A1启动子，例如为小鼠、豚鼠或人的CYP1A1启动子。在本专利技术的实施方案中，所述的CYP1A1启动子为小鼠启动子。在本专利技术的实施方案中，所述启动子基本区段包括启动子核心启动序列和近端启动序列。在本专利技术的实施方案中，所述的二本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组细胞，其为重组细胞CBG2.8D，其于2014年3月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号CGMCC No.8957。

【技术特征摘要】
1.一种重组细胞，其为重组细胞CBG2.8D，其于2014年3月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号CGMCCNo.8957。2.权利要求1的重组细胞用于二恶英类化合物生物检测的用途。3.权利要求2的用途，其中所述的二恶英类化合物选自多氯二苯并二恶英(PCDDs)、多氯二苯并呋喃(PCDFs)、多氯联苯(PCBs)、卤代芳香烃(HAHs)、多环芳香烃(PAHs)、氯代二苯醚和氯代萘，以及除以上氯代化合物外的溴代化合物及其它混合卤代化合物。4.权利要求3的用途，其中所述溴代化合物选自多溴代二苯并-对-...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵斌，李帅章，谢群慧，郑明辉，裴新辉，周志广，
申请(专利权)人：中国科学院生态环境研究中心，
类型：发明
国别省市：北京,11