用于产生对草甘膦除草剂具有抗性的植物的组合物和方法技术

本公开包括对膦酰基甲基甘氨酸家族的除草剂，例如草甘膦具有抗性的突变植物的产生。提供了用于编辑细胞中的感兴趣的核苷酸序列的组合物和方法，其采用向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统，其中Cas内切核酸酶通过向导多核苷酸引导以识别且任选地向细胞的基因组中的特定靶位点处引入双链断裂。待编辑的感兴趣的核苷酸序列可位于由Cas内切核酸酶识别的靶位点之内或之外。更具体地，提供了用于编辑细胞中的烯醇式丙酮基莽草酸‑3‑磷酸合酶(EPSPS)核苷酸序列的组合物和方法。所述方法和组合物采用向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统来提供用于编辑细胞基因组内的EPSPS核苷酸序列的有效系统。还提供了用于产生草甘膦耐受性植物细胞、植物外植体、种子和谷粒的组合物和方法。

Compositions and methods for producing plants resistant to glyphosate herbicides

The present disclosure includes the generation of a mutant herbicide resistant to a glyphosate methyl glycine family, such as glyphosate. Compositions and methods for nucleotide sequence editing in the cells of interest are provided, the polynucleotide wizard /Cas endonuclease, which Cas endonuclease through the wizard guide to identify the polynucleotide and optionally specific target cells in the genome of the point of introduction of double strand breaks. The nucleotide sequence of interest to be edited may be located within or outside the target site identified by the Cas endonuclease. More specifically, for the enol acetone based shikimic acid editing cells in 3 phosphate synthase (EPSPS) provides compositions and methods of nucleotide sequence. The methods and compositions employ a guided polynucleotide /Cas endonuclease system to provide an efficient system for editing EPSPS nucleotide sequences within a cell genome. Compositions and methods for producing glyphosate tolerant plant cells, plant explants, seeds, and grains are also provided.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于产生对草甘膦除草剂具有抗性的植物的组合物和方法本申请要求2014年7月11日提交的美国临时申请62/023246的权益，所述文献全文以引用方式并入本文。
本公开涉及分子生物学领域，具体地，涉及用于针对除草剂抗性编辑细胞基因组的方法。以电子方式递交的序列表的引用通过EFS-Web以电子方式将序列表的正式文本作为ASCII格式的序列表提交，该文件名称为“20150617_BB2366PCT_SeqLst_ST25.txt”，创建日期为2015年6月17日，文件大小为220千字节，并且该文件与本说明书同时提交。在这一ASCII格式的文件中包含的序列表为所述说明书的部分并且全文以引用方式并入本文。
技术介绍
除草剂抗性植物可减少对用以控制杂草的耕种的需要，从而有效地降低种植者的成本。具有增加的除草剂抗性的作物的开发是当前农业实践中的重大突破，因为它为农民提供了新的杂草控制选择。就此而言作为许多研究的主题的一种除草剂是N-膦酰基甲基甘氨酸，通常称为草甘膦。草甘膦抑制莽草酸途径，其导致包括氨基酸、激素和维生素的芳族化合物的生物合成。具体地，草甘膦通过抑制酶5-烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶(称为EPSPS)来遏制磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和3-磷酸基莽草酸向5-烯醇式丙酮基-3-磷酸莽草酸的转化。已使用植物基因工程方法修饰EPSP合酶DNA和所编码的蛋白质，并且将这些分子转入在农学上重要的植物中。已经分离出造成草甘膦抗性的I类EPSPS的变体(Pro-Ser，美国专利4,769,061；Gly-Ala，美国专利4,971,908；Gly-Ala、Gly-Asp，美国专利5,310,667；Gly-Ala、Ala-Thr，美国专利5,8866,775)。然而，许多EPSPS变体不是用于植物中的有效酶(Padgette等人，在“Herbicide-resistantCrops”中，第4章第53-83页.StephenDuke编辑，LewisPub，CRCPressBocaRaton，Fla.1996)。一种I类EPSPS变体，即可操作地连接至异源启动子的T-102-I/P-106-S(TIPS)，已经表现出为转基因玉米植物提供草甘膦(N-膦酰基甲基甘氨酸)抗性(美国专利6,040,497)。仍然需要开发抗除草剂作物，尤其是抗草甘膦的作物。还需要开发包含通过基因编辑获得的突变基因的具有农业价值的抗除草剂作物，其中基因的突变导致除草剂抗性。提供了用于产生表现出除草剂抗性且具体地草甘膦抗性的突变植物的组合物和方法。
技术实现思路
本公开包括对膦酰基甲基甘氨酸家族的除草剂，例如草甘膦具有抗性的突变植物的产生。提供了用于编辑细胞中的感兴趣的核苷酸序列的组合物和方法，其采用向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统，其中Cas内切核酸酶通过向导多核苷酸引导以识别且任选地向细胞的基因组中的特定靶位点处引入双链断裂。待编辑的感兴趣的核苷酸序列可位于由Cas内切核酸酶识别的靶位点之内或之外。更具体地，提供了用于编辑细胞中的烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)核苷酸序列的组合物和方法。所述方法和组合物采用向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统来提供用于编辑细胞基因组内的EPSPS核苷酸序列的有效系统。待编辑的核苷酸序列可位于由Cas内切核酸酶识别的靶位点之内或之外。细胞包括但不限于植物细胞。还提供了用于产生草甘膦耐受性或草甘膦抗性植物细胞、植物外植体、种子和谷粒的组合物和方法。因此，在本公开的第一实施方案中，所述方法包括一种用于编辑细胞中的烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)核苷酸序列的方法，该方法包括向所述细胞引入向导RNA、多核苷酸修饰模板和Cas内切核酸酶，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，该复合物使Cas内切核酸酶能够在所述细胞的基因组中的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述EPSPS核苷酸序列的至少一个核苷酸修饰。多核苷酸修饰模板还可包括EPSPS基因的非功能片段。在另一个实施方案中，所述方法包括一种用于产生烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)突变细胞的方法，该方法包括：a)向包含EPSPS核苷酸序列的细胞中引入向导RNA、Cas内切核酸酶和多核苷酸修饰模板，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，该复合物使Cas内切核酸酶能够在所述细胞的基因组中的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述EPSPS核苷酸序列的至少一个核苷酸修饰；以及b)鉴定在所述EPSPS核苷酸序列处具有至少一个核苷酸修饰的至少一个(a)的细胞，其中所述修饰包括所述EPSPS核苷酸序列中的一个或多个核苷酸的至少一个缺失、插入或置换。可通过本领域已知的方法或者通过能够表达向导RNA的重组DNA构建体的表达而将向导RNA直接引入细胞。可通过本领域已知的方法或者通过能够表达Cas内切核酸酶的重组DNA构建体的表达而将Cas内切核酸酶直接引入细胞。多核苷酸修饰模板(EPSPS多核苷酸修饰模板)可包括EPSPS基因的部分片段(并且因此其自身不编码全功能性的EPSPS多肽)。在其它实施方案中，所述方法包括一种用于复制细胞中的烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因片段的方法，一种用于替换细胞中的烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)启动子序列的方法，一种用于在细胞中的烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)核苷酸序列中插入启动子或调控元件的方法，一种用于编辑细胞中的烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)核苷酸序列的内含子元件的方法，所述方法包括向所述细胞中引入向导RNA、多核苷酸修饰模板和Cas内切核酸酶。细胞可以是但不限于任何植物细胞。在另一个实施方案中，所述方法包括一种用于产生烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)突变植物的方法，该方法包括：a)向包含EPSPS核苷酸序列的植物细胞提供向导RNA、多核苷酸修饰模板和Cas内切核酸酶，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，该复合物使Cas内切核酸酶能够在所述植物细胞的基因组中的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述EPSPS核苷酸序列的至少一个核苷酸修饰；b)由(a)的植物细胞获得植物；c)评估(b)的植物中是否存在所述至少一个核苷酸修饰；d)选择表现出草甘膦抗性的子代植物。在另一个实施方案中，所述方法包括一种用于产生烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)突变植物的方法，该方法包括：a)向包含EPSPS核苷酸序列的植物细胞提供向导RNA、多核苷酸修饰模板和Cas内切核酸酶，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，该复合物使Cas内切核酸酶能够在所述植物细胞的基因组中的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述EPSPS核苷酸序列的至少一个核苷酸修饰；b)由(a)的植物细胞获得植物；c)评估(b)的植物中是否存在所述至少一个核苷酸修饰；以及d)筛选不含所述向导RNA和Cas内切核酸酶的(c)的子代植物。本专利技术提供包含经编辑的感兴趣的基因(诸如但不限于烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因序列)的植物、植物部分、植物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于产生烯醇式丙酮基莽草酸‑3‑磷酸合酶(EPSPS)突变植物的方法，所述方法包括：a)向包含EPSPS核苷酸序列的植物细胞提供向导RNA、多核苷酸修饰模板和Cas内切核酸酶，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，所述复合物使所述Cas内切核酸酶能够在所述植物细胞的基因组中的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述EPSPS核苷酸序列的至少一个核苷酸修饰；b)由(a)的植物细胞获得植物；c)评估(b)的植物中是否存在所述至少一个核苷酸修饰；以及d)选择表现出草甘膦抗性的子代植物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.07.11 US 62/0232461.一种用于产生烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)突变植物的方法，所述方法包括：a)向包含EPSPS核苷酸序列的植物细胞提供向导RNA、多核苷酸修饰模板和Cas内切核酸酶，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，所述复合物使所述Cas内切核酸酶能够在所述植物细胞的基因组中的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述EPSPS核苷酸序列的至少一个核苷酸修饰；b)由(a)的植物细胞获得植物；c)评估(b)的植物中是否存在所述至少一个核苷酸修饰；以及d)选择表现出草甘膦抗性的子代植物。2.一种用于产生烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)突变植物的方法，所述方法包括：a)向包含Cas内切核酸酶和EPSPS核苷酸序列的植物细胞提供向导RNA和多核苷酸修饰模板，其中所述Cas内切核酸酶在所述植物细胞的基因组中的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述EPSPS核苷酸序列的至少一个核苷酸修饰；b)由(a)的植物细胞获得植物；c)评估(b)的植物中是否存在所述至少一个核苷酸修饰；以及d)选择表现出草甘膦抗性的子代植物。3.一种用于产生烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)突变植物的方法，所述方法包括：a)获得植物或其种子，其中所述植物或所述种子在内源性EPSPS基因中包含修饰，所述修饰通过Cas内切核酸酶、向导RNA和多核苷酸修饰模板产生，其中所述植物或所述种子对草甘膦具有抗性；以及b)产生不含所述向导RNA和Cas内切核酸酶的子代植物。4.一种产生草甘膦抗性玉米植物的方法，所述方法包括提供玉米植物细胞，其中所述玉米植物细胞的内源性染色体EPSPS基因已通过向导RNA/Cas内切核酸酶系统进行修饰以产生草甘膦抗性EPSPS蛋白；以及由所述玉米植物细胞培育玉米植物，其中所述植物对草甘膦具有抗性。5.一种由权利要求1-4中任一项所述的方法产生的植物。6.一种由权利要求5所述的植物产生的种子。7.一种向导RNA，其中所述可变靶向域靶向植物EPSPS核苷酸序列的片段。8.一种用于产生烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)突变植物细胞的方法，所述方法包括：a)向包含EPSPS核苷酸序列的细胞提供向导RNA、Cas内切核酸酶和多核苷酸修饰模板，其中所述向导RNA和Cas内切核酸酶能够形成复合物，所述复合物使所述Cas内切核酸酶能够在所述细胞的基因组中的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述EPSPS核苷酸序列的至少一个核苷酸修饰；以及b)获得在所述EPSPS核苷酸序列处具有至少一个核苷酸修饰的至少一个(a)的植物细胞，其中所述修饰包括所述EPSPS核苷酸序列中的一个或多个核苷酸的至少一个缺失、插入或置换。9.一种用于产生烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)突变植物细胞的方法，所述方法包括：a)向包含Cas内切核酸酶和EPSPS核苷酸序列的植物细胞提供向导RNA和多核苷酸修饰模板，其中所述Cas内切核酸酶在所述植物细胞的基因组中的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述EPSPS核苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：V德祖卡诺维，SC乔内斯，ZB刘，M拉斯纳，LA赖兹尼克，
申请(专利权)人：纳幕尔杜邦公司，先锋国际良种公司，
类型：发明
国别省市：美国,US