人类肝脏支架制造技术

本发明专利技术涉及用于去细胞化人类肝脏组织以生产例如用于治疗或疾病建模中的人类肝脏细胞外基质(ECM)支架的方法。方法涉及，例如，通过冻融，然后，对肝脏组织施加多个循环的渗透应力，以机械方式破坏组织中的细胞，进行洗涤剂处理和蛋白酶和/或DNA酶处理，以生产去细胞化的人类ECM支架。

Human liver stent

The present invention relates to methods for the removal of human liver tissue to produce human liver extracellular matrix (ECM) scaffolds, such as for therapeutic or disease modeling. The method involves, for example, by freezing and thawing, and then, a plurality of liver tissue to osmotic stress cycle, mechanically damaged tissue cells were detergent treatment and protease and / or DNA enzyme treatment, to produce human ECM cells of bracket.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】人类肝脏支架本专利技术涉及例如用于治疗、药物筛选、生物标志物识别或疾病建模中的人类肝脏细胞外基质(ECM)支架的制作。组织工程是旨在通过恢复器官功能来改善全世界数百万人的生活质量的新兴领域。组织工程组合细胞和支架，以便发展3D结构，以便在体外重新生成器官并重现疾病。除恢复器官功能之外，组织工程还可以提供重要的生物医学应用，包括用于治疗药物和生物制剂的体外试验的平台、用于测试药物毒性的平台，用于对新设备和介入性技术的评估的平台，以及用于发现新生物标志物的平台。人类肝脏是分成多个功能子单元，称为段(带有单个门静脉和动脉供应，肝脏静脉和胆汁引流的8个段)和区段(共享血管和胆道蒂的更多段)的单一器官。这些解剖特征使人类肝脏分为可以用于肝脏切除和分段肝脏移植实践中的多个功能子单元。传统上，来自门静脉和肝脏动脉系统的血以顺行的方式灌注人类肝脏；血被肝脏静脉系统排出，胆汁由肝脏通过胆管系统分泌。肝脏具有各种各样的功能，包括解毒、蛋白质合成，消化所需的生物化学物质的产生，以及在碳水化合物和脂类代谢中起着关键作用。肝脏是存活所必需的；当前没有长期补偿肝功能不存在的办法。此独特功能是通过以构成3D支架的细胞外基质(ECM)-蛋白质的网络严格地组织的实质细胞和非实质细胞合作地形成。由于病毒感染、酒精及其他情况导致的肝脏疾病越来越多，当前，在英国，每年导致10,000人死亡，在美国，导致32,000人死亡。肝脏移植是晚期急性或慢性肝病的唯一有效的治疗方案，并与极好的长期存活和生活质量相关联。然而，可供移植的肝源是有限的，需求却是越来越大。等待时间越来越长，15％至25％的适于肝脏移植的人在等待中死亡或身体变得太差。开发人工肝脏将会减少由于肝脏疾病而导致的死亡，并将为没有器官供移植的病人提供解决方案。另外，用于研究肝脏纤维化(HF)以及肝细胞癌(HCC)发展的所有模型具有固有的问题。如此，对2D单层单细胞培养或混合细胞培养的研究形成了大多数体外研究的主轴，但是，大大地远离现实。另外，大多数动物模型，虽然与人类疾病共有许多特征，但是，不与人类共有相同的基因表达模式，它们作为体内模型的有效性是有限的。如此，有开发再现人类疾病的复杂性的模型的尚未满足的需求。近年来，评估了使用例如猪和羊之类的大型动物的肝脏，获得用于利用人类细胞来再增殖的合适的支架的可能性。然而，除肝脏的新陈代谢能力的内在差别之外，细胞外ECM支架在不同的物种中具有不同的宏观特征和微观特征。具体而言，人类肝脏的分段和分叶不如其他物种那么明显。另外，人类肝脏的微观小叶解剖和结构是独特的，并且不同于例如猪之类的其他哺乳动物，因为肝脏小叶之间的纤维化边界在人类中不存在(并且，人类小叶结构没有正式的结构边界)。猪肝脏的典型的纤维化边界的存在代表了在利用人类细胞再增殖之后从猪肝脏中获取的支架用于人类的移植中的主要问题。实际上，猪的不同的结构可能会导致门静脉高压，因为搭桥会容易导致正常人类肝脏中的流动阻塞。重现3D人类ECM蛋白质的成份和组织的3D人类肝脏组织的体外发展是组织工程领域的主要挑战之一。一种有前途的方法涉及通过组织去细胞化方法来制作生物支架。然而，由于人类所特有的并且不同于其他哺乳动物的宏观和微观结构的固有的差异，以前的其他作者的报告未能获得3D人类肝脏支架。尽管报告了小鼠、大鼠、白鼬、羊和猪肝脏的去细胞化，但是，没有出版物描述人类肝脏生物支架的成功产生。专利技术人认识到，可以使用包括利用不同的细胞破坏试剂的组的一个或多个处理循环的方法来去细胞化人类肝脏组织，而不会破坏细胞外基质。这可以对维护人类肝脏的细胞外基质的结构和形态的非细胞的支架的可重复的生产有用。本专利技术的一个方面提供生产人类肝脏支架的方法，包括(i)提供人类肝脏组织，(ii)以机械方式破坏组织中的细胞，(iii)对组织中的细胞施加渗透应力，(iv)可任选地使组织暴露于蛋白酶和/或DNA酶中，以及(v)使组织暴露于洗涤剂中，以及(vi)重复步骤(iii)、步骤(iv)和步骤(v)，以及可任选地，步骤(ii)中的每一个步骤一次或多次，由此，生产人类肝脏支架。在一些实施例中，该方法可以包括步骤(iv)。在其他实施例中，可以省略步骤(iv)(即，方法不包括步骤(iv))。通过要求保护的方法生产的人类肝脏支架包括非细胞的人类肝脏细胞外基质(ECM)(即，支架是去细胞化的)，并保留源肝脏组织的ECM的三维结构和生物活性。在细胞被以机械方式破坏之后，按顺序使肝脏组织暴露于不同的去细胞化试剂(即，渗透应力试剂，蛋白酶/DNA酶和洗涤剂)中。步骤(iii)、(iv)和(v)，以及可任选地，步骤(ii)可以以任何顺序执行一次或多次，以去细胞化支架。在一些实施例中，可以以任何顺序，对肝脏组织执行包括步骤(iii)、(iv)和(v)，以及可任选地步骤(ii)中的任何一个、两个或全部三个步骤的多个循环。在一些实施例中，步骤(ii)可以重复一次或多次。例如，可以对肝脏组织执行包括步骤(ii)的多个循环。这可以例如当使用例如超声波之类的非冻融技术来以机械方式破坏细胞时有用。优选地，在步骤(iii)至(vi)中，对肝脏组织施加流体切应力。这会促进组织内去细胞化试剂的渗透，例如，渗透到肝窦状隙中，并将细胞和细胞碎片与细胞外基质(ECM)分离。可以使用任何适当的技术在肝脏组织中生成流体切应力，包括灌注、搅动或负压。优选地，通过灌注或搅动，在人类肝脏组织中生成流体切应力。对用于生成流体切应力的技术的选择可以取决于肝脏组织或应用。例如，可以利用去细胞化试剂灌注整个肝脏、单瓣扇段，段或其他肝脏结构单元以生成流体切应力。可以将例如肝脏组织块(LTC)之类的小肝脏样本浸入在去细胞化试剂中，并搅动以生成流体切应力。可以从不适合用于移植临床用途的人类肝脏中获取如此处所描述的用于去细胞化的人类肝脏组织。可以根据相应的国家法律和伦理原则，获取合适的肝脏。在一些实施例中，肝脏组织可以是没有表现出与损坏或疾病相关联的病理的正常组织。在其他实施例中，肝脏组织可以是表现出与损伤或疾病相关联的病理的病理组织。例如，肝脏组织可以是多脂的，纤维化的，发炎的或表现出与疾病或损伤相关联的一个或多个其他特征。在一些实施例中，病理肝脏组织可以表现出与急性或慢性肝病相关联的病理，包括病毒感染，例如甲肝、乙肝、丙肝、丁肝或戊肝、酒精或毒素损伤、肝脏纤维化(HF)、非酒精脂肪肝疾病(NAFLD)、原发性硬化性胆管炎(PSC)、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、酒精性肝病、缺血性肝炎、巨细胞性肝炎，以及例如肝细胞癌(HCC)之类的肝癌。可另选地，病理肝脏组织可以表现出与影响肝脏的其他疾病相关联的病理，例如淀粉样变性。用病理肝脏组织产生的肝脏支架可能具有用健康肝脏组织产生的支架不同的结构和成份。例如，与健康的肝脏组织相比，在从病理肝脏组织产生的支架中，病理支架的形态或例如胶原、肌腱蛋白和层粘连蛋白之类的ECM成份的量或相对量可能会改变。这可能对获取用于疾病建模的特定疾病改变的肝脏支架有用。可以从患有肝脏疾病或影响肝脏的疾病(例如，以肝脏损伤或肝功能改变为特征的疾病)的个体获取病理肝脏组织。如此处所描述的获取和存储用于去细胞化的肝脏组织的方法当前是已知的。例如，可以使肝脏肝素化以防止凝聚，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产人类肝脏支架的方法，包括：(i)提供人类肝脏组织，(ii)以机械方式破坏所述组织中的细胞，(iii)对所述组织中的所述细胞施加渗透应力，(iv)可任选地使所述组织暴露于蛋白酶和/或DNA酶中，以及(v)使所述组织暴露于洗涤剂中，以及(vi)以任何顺序重复步骤(iii)、步骤(iv)和步骤(v)中的每一个步骤一次或多次，由此生产人类肝脏支架。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.06.03 GB 1409858.61.一种生产人类肝脏支架的方法，包括：(i)提供人类肝脏组织，(ii)以机械方式破坏所述组织中的细胞，(iii)对所述组织中的所述细胞施加渗透应力，(iv)可任选地使所述组织暴露于蛋白酶和/或DNA酶中，以及(v)使所述组织暴露于洗涤剂中，以及(vi)以任何顺序重复步骤(iii)、步骤(iv)和步骤(v)中的每一个步骤一次或多次，由此生产人类肝脏支架。2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(ii)被重复一次或多次。3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中，对所述肝脏执行包括步骤(iii)、(iv)和(v)中的一个步骤，两个步骤或所有三个步骤的多个循环的处理。4.根据权利要求1至3中的任何一项所述的方法，其中，对所述肝脏执行包括步骤(ii)的多个循环的处理。5.根据前面的权利要求中的任何一项所述的方法，其中，所述肝脏组织是正常的肝脏组织。6.根据权利要求1至4中的任何一项所述的方法，其中，所述肝脏组织是病理肝脏组织。7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述病理肝脏组织表现出与急性肝病或慢性肝病相关联的病理。8.根据前面的权利要求中的任何一项所述的方法，其中，通过对所述组织进行一轮或多轮冻融，以机械方式破坏所述细胞。9.根据前面的权利要求中的任何一项所述的方法，其中，通过对所述组织进行HIFU或超声处理，以机械方式破坏所述细胞。10.根据前面的权利要求中的任何一项所述的方法，其中，通过使所述组织暴露于低渗试剂中，对所述肝脏组织施加渗透应力。11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述低渗试剂是去离子水。12.根据前面的权利要求中的任何一项所述的方法，其中，通过使所述组织暴露于高渗试剂中，对所述肝脏组织施加渗透应力。13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述高渗试剂是水或盐水。14.根据前面的权利要求中的任何一项所述的方法，其中，所述方法包括步骤(iv)。15.根据权利要求14所述的方法，其中，在步骤(iv)中，使所述组织暴露于蛋白酶中。16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述蛋白酶是胰蛋白酶或链霉蛋白酶。17.根据权利要求14至16中的任何一项所述的方法，其中，在步骤(iv)中，使所述组织暴露于DNA酶中。18.根据权利要求1至13中的任何一项所述的方法，其中，所述方法不包括步骤(iv)。19.根据前面的权利要求中的任何一项所述的方法，其中，所述洗涤剂是阴离子洗涤剂。20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述阴离子洗涤剂是十二烷基磷酸钠(SDS)或脱氧胆酸钠(SdC)。21.根据前面的权利要求中的任何一项所述的方法，其中，所述洗涤剂是离子型洗涤剂。22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述离子型洗涤剂是聚乙二醇p-(1,1,3,3-四甲基丁基)-二苯醚(TritonX100TM)。23.根据前面的权利要求中的任何一项所述的方法，其中，使所述人类肝脏组织暴露于离子型洗涤剂和阴离子洗涤剂两者中。24.根据前面的权利要求中的任何一项所述的方法，其中，在步骤(iii)至(vi)中，对所述肝脏组织施加流体切应力。25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述流体切应力通过灌注来生成。26.根据权利要求25所述的方法，其中，对所述肝脏组织在逆行方向上进行灌注。27.根据权利要求25或权利要求26所述的方法，其中，将灌注速率提高到目标值。28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述初始灌注速率是0.1-1.99ml/min/g组织。29.根据权利要求27或权利要求28所述的方法，其中，所述目标灌注速率是2-20ml/min/g组织。30.根据权利要求25至29中的任何一项所述的方法，其中，利用每一去细胞化试剂，对所述肝脏组织进行灌注，每克实体组织大约0.004至大约4小时。31.根据权利要求25至30中的任何一项所述的方法，其中，步骤(vi)包括通过灌注所述肝脏组织，重复步骤(iii)和(v)1至25次。32.根据权利要求25至31中的任何一项所述的方法，其中，步骤(vi)包括通过灌注所述肝脏组织，按以下顺序，重复步骤(iii)至(v)：(iii),(iv),(iii),(iv)(v),[(iii),(v)]n,(iii),(iv),[(iii),(v)]n，其中，n是1至25。33.根据权利要求25至31中的任何一项所述的方法，其中，步骤(vi)包括通过灌注所述肝脏组织，重复步骤(iii)和(v)1至25次。34.根据权利要求31至33中的任何一项所述的方法，其中，步骤(ii)被重复一次或多次。3...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱塞佩·马扎，马西莫·马拉加，保罗·德·科皮，马西莫·平扎尼，
申请(专利权)人：伦敦大学学院商业有限公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB