合成的抗微生物多肽制造技术

本发明专利技术涉及具有抗微生物活性的多肽和具有编码多肽的核苷酸序列的多核苷酸。本发明专利技术还涉及核酸构建体、载体和包含核酸构建体的宿主细胞以及生产和使用该多肽的方法。

【技术实现步骤摘要】
合成的抗微生物多肽本申请是于2004年9月13日提出的、申请号为200480033242.5、发 明创造名称为"合成的抗微生物多肽"的中国专利技术专利申请的分案申请。
技术介绍
抗微生物肽(AMP)是相对新近发现的一组具有新作用模式的抗微生物剂。AMP广泛分布于动物、植物和微生物并且属于最古老的宿主防御因 子。绝大多数的该种肽在天然情况下是阳离子的和两亲性的；该特性允许 与带负电荷的细菌或真菌的膜相互作用。该种肽大小范围从6-7个氨基酸至60个氨基酸。迄今为止已经分离出 500种以上不同的AMP。基于结构或M酸组成可以将它们分为几类。最 简单的结构是小的"-螺旋肽。其它AMP折叠形成/3-片层结构，而另外的 再次形成刚性的二硫桥连接的三级结构。AMP通常是杀微生物的(与静止相对)并且作用极其快。通常，乾生 物在几分钟之内被杀死。它们通过干扰把生物的膜功能而起作用。已经显 示存在几种不同的作用机制，但是对于大多数AMP，总体结果AM破裂和 /或细胞裂解。对微生物膜的选择性是由膜组成、膜电荷和跨膜电位介导的。微生物 膜比更高等生物的膜具有较高的负电荷，其包含不同类型的磷脂而不含胆 固醇。已经证明在耙生物中诱导对AMP的抗性极端困难。这是乾标的原因； 为了显著性改变膜组成或电荷，靶标将不得不发生多重基因组改变。专利技术概述在本专利技术的第一个方面涉及具有抗微生物活性的多肽，其包含氨基酸序列XrX2-XrX4-Xs;其中&、 X2、 X3、 X4和X5中的每一个选自M ^f列P-P-R陽F、 P-R-F-P、 R-F誦P-P、 F-P-P画R、 P-R画P-F、 R-P-F-P、 P-F-P-R、 F-P-R-P、 P-P-F-R、 P-F-R-P、 F-R-P-P、 R-P-P-F、 P誦P-R-L、 P-R-L國P、 R-L画P-P、 L誦P-P-R、 P-R-P-L、 R-P-L國P、 P誦L-P-R、 L-P-R-P、 P國P-L-R、 P-L-R-P、 L-R陽P-P、 R-P-P隱L、 P-P画R-V、 P-R-V-P、 R-V-P-P、 V-P-P-R、 P-R-P-V、 R誦P-V-P、 P-V-P画R、 V-P-R-P、 P-P-V-R、 P誦V-R-P、 V画R-P-P、 R-P-P-V、 P画P-R-I、 P曙R-I曙P、 R-I-P-P、 I-P-P-R、 P隱R-P画I、 R-P-I-P、 P-I-P-R、 I誦P-R-P、 P画P小R、 P小R-P、 I-R-P画P和R-P-P-I;并且其中X广Xs中最多 4个是相同的。在本专利技术的第二个方面涉及具有编码本专利技术多肽的核苷酸序列的多核 苷酸。在本专利技术的第三个方面涉及包含编码本专利技术多肽的核苷酸序列的核酸 构建体，该核苷酸序列与指导多肽在适当宿主中产生的一个或多个控制序 列有效连接。在本专利技术的第四个方面涉及包含本专利技术核酸构建体的重组表达栽体。 在本专利技术的第五个方面涉及包含本专利技术核酸构建体的重组宿主细胞。 在本专利技术的第六个方面涉及生产本专利技术多肽的方法，该方法包括(a) 在有利于多肽产生的条件下培养重组宿主细胞；和(b) 回收多肽。本专利技术的其它方面在以下描述和附加权利要求中是显而易见的。定义在更加详细地讨论本专利技术之前，首先定义以下术语和规定 抗微生物活性:术语"抗微生物活性"文中定义为能够杀死或抑制微 生物细胞生长的活性。在本专利技术的上下文中，术语"抗微生物的"旨在指 具有杀菌和/或抑菌和/或杀真菌和/或抑真菌作用和/或杀病射用，其中术语"杀菌的"应理解为能够杀死细菌细胞。术语"抑菌的，，应理解为能够 抑制细菌生长，即抑制正在生长的细菌细胞。术语"杀真菌的"应理解为 能够杀死真菌细胞。术语"抑真菌的"应理解为能够抑制真菌生长，即抑 制正在生长的真菌细胞。术语"杀病毒的"应理解为能够使病毒失活。术 语"微生物细胞"指细菌或真菌细胞(包括酵母)。在本专利技术的上下文中，术语"抑制微生物细胞生长"旨在指细胞处于 非生长状态，即它们不能够繁殖。为了本专利技术的目的，按照Lehrer等(Journal of Immunological Methods,第137巻，(2)第167-174页，1991)所描述的方法可以确定抗微 生物活性。在具有抗微生物活性多肽的25。/。(w/w)水溶液中；优选地在10%(w/w) 水溶液中；更加优选地在5。/。(w/w)水溶液中；甚至更加优选地在l%(w/w) 水溶液中；最优选地在0.5。/。(w/w)水溶液中；并且具体而言在0.1%(w/w) 水溶液中于20。C孵育8小时后(优选地4小时后，更加优选地2小时后， 最优选地l小时后，并且具体而言30分钟后)，具有抗微生物活性的多肽 能够将大肠杆菌(五sc/^i7Y^iVi cv/,') (DSM 1576)的活细胞数量降低至 1/100。当加入具有抗微生物活性多肽的浓度为1000 ppm时；优选地为500 ppm时；更加优选地为250 ppm时；甚至更加优选地为100 ppm时；最优 选地为50ppm时；并且具体而言为25 ppm时，该多肽还能够在25。C下 抑制大肠杆菌(DSM 1576)在微生物生长基质中生长达24小时。在具有抗微生物活性多肽的25。/。(w/w)水溶液中；优选地在10%(w/w) 水溶液中；更加优选地在5。/。(w/w)水溶液中；甚至更加优选地在l%(w/w) 水溶液中；最优选地在0.5。/。(w/w)水溶液中；并且具体而言在0.1%(w/w) 水溶液中于20。C孵育8小时后(优选地4小时后，更加优选地2小时后， 最优选地1小时后，并且具体而言为30分钟后)，具有抗微生物活性的多 肽能够将枯草芽孢杆菌(5aci7/MS swMto) (ATCC 6633)的活细胞数量降 低至1/100,当加入具有抗微生物活性多肽的浓度为1000 ppm时；优选地为500 卯m时；更加优选地为250 ppm时；甚至更加优选地为100 ppm时；最优 选地为50卯m时；并且具体而言为25 ppm时，该多肽还能够在25。C下 抑制枯草芽孢杆菌(ATCC 6633)在微生物生长基质中生长达24小时。本专利技术多肽将优选地具有由SEQ ID NO:l至SEQ ID NO:319中任意 一个"H&酸序列所组成多肽的抗微生物活性的至少20%。在特别优选的实 施方案中，多肽将具有由SEQ ID NO:l至SEQ ID NO:319中任意一个氨 基酸序列所组成多肽的抗微生物活性的至少40%，例如至少50%，优选地 至少60%,例如至少70%,更加优选地至少80%,例如至少90%,最优 选地至少95%，例如大约或至少100%。片段:当文中使用时，本专利技术M,列的"片段"是多肽的亚序列， 其中^J^末端和/或g末端的一个或多个氨基酸已经缺失。优选地为从羧 基末端缺失一个或多个氨基酸。优选地，片段由至少20个氨基酸组成。等位基因变体:在本文中，术语"等位基因变体"表示占据同一染色 体位点的基因的任意两种或多种可选择形式。等位基因变体在天然情况下 通过突变产生，并且可以导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(没 有改变所编码多肽)或者可以编码M酸序列发生改变的多肽。多肽的等 位基因变体是由基本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有抗微生物活性的多肽，其包含氨基酸序列：Ｘ↓［１］－Ｘ↓［２］－Ｘ↓［３］－Ｘ↓［４］－Ｘ↓［５］；其中Ｘ↓［１］、Ｘ↓［２］、Ｘ↓［３］、Ｘ↓［４］和Ｘ↓［５］中的每一个选自氨基酸序列：Ｐ－Ｐ－Ｒ－Ｆ、Ｐ－Ｒ－Ｆ－Ｐ、Ｒ－Ｆ－Ｐ－Ｐ、Ｆ－Ｐ－Ｐ－Ｒ、Ｐ－Ｒ－Ｐ－Ｆ、Ｒ－Ｐ－Ｆ－Ｐ、Ｐ－Ｆ－Ｐ－Ｒ、Ｆ－Ｐ－Ｒ－Ｐ、Ｐ－Ｐ－Ｆ－Ｒ、Ｐ－Ｆ－Ｒ－Ｐ、Ｆ－Ｒ－Ｐ－Ｐ、Ｒ－Ｐ－Ｐ－Ｆ、Ｐ－Ｐ－Ｒ－Ｌ、Ｐ－Ｒ－Ｌ－Ｐ、Ｒ－Ｌ－Ｐ－Ｐ、Ｌ－Ｐ－Ｐ－Ｒ、Ｐ－Ｒ－Ｐ－Ｌ、Ｒ－Ｐ－Ｌ－Ｐ、Ｐ－Ｌ－Ｐ－Ｒ、Ｌ－Ｐ－Ｒ－Ｐ、Ｐ－Ｐ－Ｌ－Ｒ、Ｐ－Ｌ－Ｒ－Ｐ、Ｌ－Ｒ－Ｐ－Ｐ、Ｒ－Ｐ－Ｐ－Ｌ、Ｐ－Ｐ－Ｒ－Ｖ、Ｐ－Ｒ－Ｖ－Ｐ、Ｒ－Ｖ－Ｐ－Ｐ、Ｖ－Ｐ－Ｐ－Ｒ、Ｐ－Ｒ－Ｐ－Ｖ、Ｒ－Ｐ－Ｖ－Ｐ、Ｐ－Ｖ－Ｐ－Ｒ、Ｖ－Ｐ－Ｒ－Ｐ、Ｐ－Ｐ－Ｖ－Ｒ、Ｐ－Ｖ－Ｒ－Ｐ、Ｖ－Ｒ－Ｐ－Ｐ、Ｒ－Ｐ－Ｐ－Ｖ、Ｐ－Ｐ－Ｒ－Ｉ、Ｐ－Ｒ－Ｉ－Ｐ、Ｒ－Ｉ－Ｐ－Ｐ、Ｉ－Ｐ－Ｐ－Ｒ、Ｐ－Ｒ－Ｐ－Ｉ、Ｒ－Ｐ－Ｉ－Ｐ、Ｐ－Ｉ－Ｐ－Ｒ、Ｉ－Ｐ－Ｒ－Ｐ、Ｐ－Ｐ－Ｉ－Ｒ、Ｐ－Ｉ－Ｒ－Ｐ、Ｉ－Ｒ－Ｐ－Ｐ和Ｒ－Ｐ－Ｐ－Ｉ；并且其中Ｘ↓［１］－Ｘ↓［５］中最多４个是相同的。...

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：HHK赫根豪格，
申请(专利权)人：诺和酶股份有限公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]