鱼精多肽中的抗氧化二肽的分离纯化工艺制造技术

一种鱼精多肽中的抗氧化二肽的分离纯化工艺，实施步骤如下：　　　　（１）取鱼精多肽，即鱼精蛋白酶解产物０．２５－０．５ｇ溶解在５－１０ｍｌ双蒸水中，１００００ｒｐｍ离心８－１０ｍｉｎ，取上清液；　　　　（２）上清液上样到Ｓｅｐｈａｄｅｘ　　Ｇ－３５柱２６×４５０ｍｍ，双蒸水以０．６ｍｌ／ｍｉｎ流速洗柱；在２５４ｎｍ下监测流出样品，根据检测器的样品峰收集每个组分，视收集样品和出峰时间的时间差，且根据出峰时间再延期３－６秒收集；收集完成后，各收集管中样品合并，立即放在－８０℃冷冻保存；－８０℃下的样品迅速放入也预冷的冷冻干燥器中，冻干后得到冻干粉，双蒸水溶解成不同浓度用于测定自由基的清除活性和进一步分离纯化；　　　　（３）将最高抗氧化活性的组分收集、冻干，过程与步骤（２）相同，进一步利用Ｍａｃｒｏ－Ｐｒｅｐ　　Ｈｉｇｈ　　Ｑ柱１６×１５０ｍｍ分离纯化，柱子先用２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液ｐＨ８．３、以０．８ｍｌ／ｍｉｎ流速，预处理１ｈ；上样后，柱子用２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液ｐＨ８．３以０．８ｍｌ／ｍｉｎ流速洗脱３０ｍｉｎ，然后以线形梯度为０－０．３５Ｍ　　ＮａＣｌ的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液２０ｍＭ，ｐＨ８．３洗脱，洗脱曲线在２５４ｎｍ下检测；每个组分根据洗脱峰被收集、冷冻干燥；冻干后得到冻干粉，双蒸水溶解成不同浓度用于测定自由基的清除活性和进一步分离纯化；　　　　（４）冻干粉溶解成较高浓度，用５ｍｌ注射器上样，然后用５ｍｌ　　Ｈｉ－Ｔｒａｐ脱盐柱处理，在２５４ｎｍ检测，根据洗脱峰收集，收集冻干；冻干后得到冻干粉，双蒸水溶解成不同浓度用于测定自由基的清除活性和进一步分离纯化；　　　　（５）最高羟自由基清除活性的多肽组分通过具有二级管阵列（ＰＤＡ）Ｗａｔｅｒｓ　　２６９５　　ＨＰＬＣ系统进一步分离纯化，分离柱为１０×２５０ｍｍ、Ｃ↓［４］的反相柱ＹＭＣ－Ｐａｃｋ　　ＰＲＯＴＥＩＮ－ＲＰ；用含０．１％三氟乙酸的３％乙腈洗脱，在２８０ｎｍ下检测，根据洗脱峰收集，手动收集样品，然后冻干；冻干后得到冻干粉，双蒸水溶解成不同浓度用于测定自由基的清除活性和进一步分离纯化；　　　　（６）活性组分被收集浓缩，最高活性组分进一步通过３．９×１５０ｍｍ的反相分离柱Ｓｙｍｍｅｔｒｙ　　Ｓｈｉｅｌｄ↑［ＴＭ］　　ＲＰ１８分离，用含０．１％三氟乙酸的线形梯度５－１５％乙腈以０．８ｍｌ／ｍｉｎ速度洗脱，在２５４ｎｍ下检测，根据洗脱峰收集，手动收集样品，然后冻干；冻干后得到冻干粉，双蒸水溶解成不同浓度用于测定自由基的清除活性和结构鉴定。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种鱼精多肽中的抗氧化二肽的分离纯化工艺，实施步骤如下：（１）取鱼精多肽，即鱼精蛋白酶解产物０．２５－０．５ｇ溶解在５－１０ｍｌ双蒸水中，１００００ｒｐｍ离心８－１０ｍｉｎ，取上清液；（２）上清液上样到ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－３５柱２６×４５０ｍｍ，双蒸水以０．６ｍｌ／ｍｉｎ流速洗柱；在２５４ｎｍ下监测流出样品，根据检测器的样品峰收集每个组分，视收集样品和出峰时间的时间差，且根据出峰时间再延期３－６秒收集；收集完成后，各收集管中样品合并，立即放在－８０℃冷冻保存；－８０℃下的样品迅速放入也预冷的冷冻干燥器中，冻干后得到冻干粉，双蒸水溶解成不同浓度用于测定自由基的清除活性和进一步分离纯化；（３）将最高抗氧化活性的组分收集、冻干，过程与步骤（２）相同，进一步利用Ｍａｃｒｏ－ＰｒｅｐＨｉｇｈＱ柱１６×１５０ｍｍ分离纯化，柱子先用２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液ｐＨ８．３、以０．８ｍｌ／ｍｉｎ流速，预处理１ｈ；上样后，柱子用２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液ｐＨ８．３以０．８ｍｌ／ｍｉｎ流速洗脱３０ｍｉｎ，然后以线形梯度为０－０．３５ＭＮａＣｌ的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液２０ｍＭ，ｐＨ８．３洗脱，洗脱曲线在２５４ｎｍ下检测；每个组分根据洗脱峰被收集、冷冻干燥；冻干后得到冻干粉，双蒸水溶解成不同浓度用于测定自由基的清除活性和进一步分离纯化；（４）冻干粉溶解成较高浓度，用５ｍｌ注射器上样，然后用５ｍｌＨｉ－Ｔｒａｐ脱盐柱处理，在２５４ｎｍ检测，根据洗脱峰收集，收集冻干；冻干后得到冻干粉，双蒸水溶解成不同浓度用于测定自由基的清除活性和进一步分离纯化；（５）最高羟自由基清除活性的多肽组分通过具有二级管阵列（ＰＤＡ）Ｗａｔｅｒｓ２６９５ＨＰＬＣ系统进一步分离纯化，分离柱为１０×２５０ｍｍ、Ｃ↓［４］的反相柱ＹＭＣ－ＰａｃｋＰＲＯＴＥＩＮ－ＲＰ；用含０．１％三氟乙酸的３％乙腈洗脱，在２８０ｎｍ下检测，根据洗脱峰收集，手动收集样品，然后冻干；冻干后得到冻干粉，双蒸水溶解成不同浓度用于测定自由基的清除活性和进一步分离纯化；（６）活性组分被收集浓缩，最高活性组分进一步通过３．９×１５０ｍｍ的反相分离柱ＳｙｍｍｅｔｒｙＳｈｉｅｌｄ↑［ＴＭ］ＲＰ１８分离，用含０．１％三氟乙酸的线形梯度５－１５％乙腈以０．８ｍｌ／ｍｉｎ速度洗脱，在２５４ｎｍ下检测，根据洗脱峰收集，手动收集样品，然后冻干；冻干后得到冻干粉，双蒸水溶解成不同浓度用于测定自由基的清除活性和结构鉴定。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王勇刚，韩福森，吴巧玲，王贺瑶，朱锋荣，
申请(专利权)人：天津天狮生物发展有限公司，
类型：发明
国别省市：12