一种基于银壳包覆的L‑半胱氨酸捕获金核标记的PSA传感器的制备方法及应用技术

本发明专利技术属于纳米功能材料、免疫分析以及生物传感技术领域，提供了一种基于银壳包覆的L‑半胱氨酸捕获金核标记的PSA传感器的制备方法及应用。采用银壳包覆的L‑半胱氨酸捕获金核纳米材料作为检测抗体标记物，制备的夹心型电化学免疫传感器具有特异性强，灵敏度高和检出限低等优点，对前列腺肿瘤标志物PSA的检测具有重要的科学意义和临床应用价值。

A method of preparation and application of PSA sensor with silver shells L gold labeled cysteine based on nuclear capture

The invention belongs to the nano functional materials, immunoassay, biosensor technology field, provides a method of preparation and application of PSA sensor with silver shells L gold labeled cysteine based on nuclear capture. The silver shell coated L gold nanoparticles as a nuclear cysteine capture antibody detection marker, sandwich type electrochemical immunosensor has strong specificity, high sensitivity and low detection limit, it has important scientific significance and clinical value in the detection of prostate tumor marker PSA.

【技术实现步骤摘要】
一种基于银壳包覆的L-半胱氨酸捕获金核标记的PSA传感器的制备方法及应用
本专利技术属于纳米功能材料、免疫分析以及生物传感
，提供了一种基于银壳包覆的L-半胱氨酸捕获金核标记的PSA传感器的制备方法及应用。
技术介绍
肿瘤的发病率高，生长和转移速度快，对人类的健康有极大的危害。肿瘤标记物是肿瘤细胞产生和释放的以抗原、酶、激素等形式的代谢产物存在于肿瘤细胞内或宿主体液中，其在临床上对于随原发肿瘤的发现，肿瘤高危人群的筛选、良性和恶性肿瘤的鉴别诊断、肿瘤发展程度的判断，肿瘤的治疗效果的观察和评价及肿瘤复发和预后的预测产生极大的影响，引起人们的广泛关注。前列腺癌就是发生于男性前列腺组织中的恶性肿瘤，严重影响男性的健康，在欧美等发达国家和地区，它是男性最常见的恶性肿瘤，其死亡率居各种癌症的第二位;在亚洲，前列腺癌的发病也呈快速上升趋势，因此前列腺肿瘤标志物PSA的准确检测，对前列腺癌的治疗能起到重要作用。目前对于肿瘤标记物的检测方法很多，如放射免疫分析法、免疫放射分析法、酶标记免疫分析法、化学免疫发光分析法、时间分辨荧光免疫分析法等，但多数检测方法繁琐，操作复杂，费用昂贵，检出限高，因此，建立一种快速、简便、灵敏的检测方法有重要意义。夹心型电化学免疫传感器结合了高特异性的免疫分析技术和高灵敏的电化学分析技术，具有灵敏度高、制备简单、检测快速、成本低、等优点，在临床检验、环境监测、食品安全控制、生物监测等领域都有重要的应用价值。而构建电化学免疫传感器的关键有两点：其一是采用简单、快速、有效的方法将抗原抗体等生物分子固定在电极表面；其二是开发传感器的信号放大技术。
技术实现思路
本专利技术提供了一种基于银壳包覆的L-半胱氨酸捕获金核标记的PSA传感器的制备方法及应用，实现了对前列腺肿瘤标志物PSA的高灵敏检测。本专利技术的目的之一是提供一种基于银壳包覆的L-半胱氨酸捕获金核标记的PSA传感器的制备方法。本专利技术的目的之二是将所制备的基于银壳包覆的L-半胱氨酸捕获金核标记的PSA传感器，用于检测肿瘤标志物PSA。本专利技术的技术方案，包括以下步骤。1.一种基于银壳包覆的L-半胱氨酸捕获金核标记的PSA传感器的制备方法，步骤如下：（1）将直径为3~5mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；（2）在电极表面滴加6µL，1~4mg/mL的Au@SnO2-GS，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；（3）继续将6µL、8~12µg/mL的肿瘤标志物PSA捕获抗体Ab1溶液孵化到电极表面，4℃冰箱中晾干；（4）继续将3µL，1~3mg/mL的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；（5）滴加6µL、10fg/mL~50ng/mL一系列不同浓度的PSA抗原Ag溶液到电极表面，室温下晾干，超纯水冲洗，4℃冰箱中干燥；（6）将6µL，1~3mg/mL的检测抗体孵化物Ab2-Ag-cys-Au溶液滴于电极表面，置于4℃冰箱中干燥，制得一种基于银壳包覆的L-半胱氨酸捕获金核标记的PSA传感器。2.所述Au@SnO2-GS的制备，步骤如下：（1）金纳米粒子AuNPs溶液的制备将50~80mL,质量分数为0.01%HAuCL4溶液煮沸，加入0.75~1.5mL,质量分数为1%的柠檬酸钠，搅拌，保持沸腾状态15~30min，冷却至室温，制得AuNPs溶液。（2）Au@SnO2-GS的制备将0.1mL,0.5mg/mL的SnO2-GS溶液与5~7mL上述制备的AuNPs溶液混合，搅拌12h，离心分离，超纯水洗涤三次，制得Au@SnO2-GS，将其分散于超纯水中，制成2mg/mL的溶液备用。3.所述检测抗体孵化物Ab2-Ag-cys-Au溶液的制备，步骤如下：（1）L-半胱氨酸捕获金核纳米颗粒L-cys@AuNPs的制备在25mL,2mmoL/L的L-半胱氨酸L-cys溶液中,边搅拌边依次加入250μL，0.05moL/LHAuCl4，350μL，0.01moL/L的NaBH4,在300K下搅拌2h，离心分离，超纯水洗涤，室温下真空干燥12h，制得L-cys@AuNPs，备用；（2）银壳包覆的L-半胱氨酸捕获金核纳米球Ag-cys-Au的制备10~15mL,0.1mg/mL的L-cys@AuNPs中，依次加入1mL，质量分数为1%聚乙烯吡咯烷酮PVP，1mL，0.1moL/L的抗坏血酸，1mL，0.1moL/L的AgNO3溶液，室温下搅拌30~40min，离心分离，超纯水清洗，室温下真空干燥制得Ag-cys-Au；（3）检测抗体孵化物Ab2-Ag-cys-Au溶液的制备将3~5mg的Ag-cys-Au分散到1mL超纯水中，加入1mL,20μg/mL的PSA检测抗体Ab2溶液，4℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12h，离心分离，收集所得固体，分散于PBS溶液中，制成2mg/mL的检测抗体孵化物Ab2-Ag-cys-Au溶液，储存于4℃冰箱中备用。4.肿瘤标志物PSA的检测，步骤如下：（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10mL、50mmol/L的pH5.1~8.6磷酸盐缓冲溶液中进行测试；（2）用计时电流法对肿瘤标志物PSA进行检测，输入电压为-0.4V，取样间隔0.1s，运行时间400s；（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50s向10mL、50mmol/L的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液中注入10μL、5mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。本专利技术所用原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买。本专利技术的有益成果（1）本专利技术使用了负载金纳米颗粒的二氧化锡石墨烯Au@SnO2-GS作为基底材料，金、二氧化锡石墨烯具有大的比表面积，以及良好的导电能力，能够很好的固载捕获抗体，并能加速电子的传递，对于实现传感器的高灵敏度以及低检测限具有重要意义；（2）采用银壳包覆的L-半胱氨酸捕获金核纳米球Ag-cys-Au作为检测抗体标记物，Au和Ag具有良好的导电能力以及对过氧化氢有催化作用，实现了信号的双重协同放大，因此提高了传感器的灵敏度，降低了检测限；（3）一种基于银壳包覆的L-半胱氨酸捕获金核标记的PSA传感器对肿瘤标志物PSA的检测，其线性范围10fg/mL～50ng/mL，检测限最低3.3fg/mL。具体实施方式现将本专利技术通过具体实施方式进一步说明，但不限于此实施例1一种基于银壳包覆的L-半胱氨酸捕获金核标记的PSA传感器的制备方法，步骤如下：（1）将直径为3mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；（2）在电极表面滴加6µL，1mg/mL的Au@SnO2-GS，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；（3）继续将6µL、8µg/mL的肿瘤标志物PSA捕获抗体Ab1溶液孵化到电极表面，4℃冰箱中晾干；（4）继续将3µL，1mg/mL的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；（5）滴加6µL、10fg/mL~50ng/mL一系列不同浓度的PSA抗原Ag溶液到电极表面，室温下晾干，超纯水冲洗，4℃冰箱中干燥；（6）将6µL，1mg/mL的检测抗体孵化本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于银壳包覆的L‑半胱氨酸捕获金核标记的PSA传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：（1）将直径为3 ~ 5mm的玻碳电极用Al

【技术特征摘要】
1.一种基于银壳包覆的L-半胱氨酸捕获金核标记的PSA传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：（1）将直径为3~5mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；（2）在电极表面滴加6µL，1~4mg/mL的Au@SnO2-GS，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；（3）继续将6µL、8~12µg/mL的肿瘤标志物PSA捕获抗体Ab1溶液孵化到电极表面，4℃冰箱中晾干；（4）继续将3µL，1~3mg/mL的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；（5）滴加6µL、10fg/mL~50ng/mL一系列不同浓度的PSA抗原Ag溶液到电极表面，室温下晾干，超纯水冲洗，4℃冰箱中干燥；（6）将6µL，1~3mg/mL的检测抗体孵化物Ab2-Ag-cys-Au溶液滴于电极表面，置于4℃冰箱中干燥，制得一种基于银壳包覆的L-半胱氨酸捕获金核标记的PSA传感器。2.如权利要求1所述的一种基于银壳包覆的L-半胱氨酸捕获金核标记的PSA传感器的制备方法，所述Au@SnO2-GS的制备，其特征在于，步骤如下：（1）金纳米粒子AuNPs溶液的制备将50~80mL,质量分数为0.01%HAuCL4溶液煮沸，加入0.75~1.5mL,质量分数为1%的柠檬酸钠，搅拌，保持沸腾状态15~30min，冷却至室温，制得AuNPs溶液；（2）Au@SnO2-GS的制备将0.1mL,0.5mg/mL的SnO2-GS溶液与5~7mL上述制备的AuNPs溶液混合，搅拌12h，离心分离，超纯水洗涤三次，制得Au@SnO2-GS，将其分散于超纯水中，制成2mg/mL的溶液备用。3.如权利要求1所述的一种基于银壳包覆的L-半胱氨酸捕获金核标记的PSA传感器的制备方法，所述检测抗体孵化物Ab2-Ag-cys-Au溶液的制备，其特征在于，步骤如下：（1）L-半胱氨酸捕获金核纳米...

【专利技术属性】
技术研发人员：李月云，王平，姜丽萍，董云会，刘青，刘会，陈磊，
申请(专利权)人：山东理工大学，
类型：发明
国别省市：山东,37