金黄色葡萄球菌黏附素蛋白抗体的抗黏附能力的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种金黄色葡萄球菌黏附素蛋白抗体的抗黏附能力的检测方法，包括：(1)pET‑FnbpB‑D的诱导表达；(2)目的蛋白免疫实验兔后的抗血清制备；(3)抗体抗黏附能力的检测。本发明专利技术通过将S.aureus菌株的FnbpB基因进行克隆表达后，再对表达产物的特异性抗体的抗黏附能力进行检测，进而为以FnbpB为靶位的S.aureus的黏附素疫苗提供参考。本发明专利技术还为金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎疫苗的研究提供试验依据。

Method for detecting anti adhesion ability of antibody of Staphylococcus aureus adhesin protein

Including the detection method, the invention discloses a Staphylococcus aureus adhesin protein antibody anti adhesion ability: (1) pET FnbpB induced expression of D; (2) to immunize rabbits after antiserum preparation; (3) to detect antibodies against adhesion ability. The FnbpB gene of S.aureus strain was cloned and expressed after specific antibody on the expression of the anti adhesion capacity of the product testing, in order to provide reference for adhesion with FnbpB as the target of the S.aureus peptide vaccine. The invention also provides the experimental basis for the study of Staphylococcus aureus mastitis vaccine.

【技术实现步骤摘要】
金黄色葡萄球菌黏附素蛋白抗体的抗黏附能力的检测方法
本专利技术涉及分子生物学
，具体是一种金黄色葡萄球菌黏附素蛋白抗体的抗黏附能力的检测方法。
技术介绍
金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，简称S.aureus)是奶牛乳房炎的主要病原菌，近50％的奶牛乳房炎是由该菌引起。奶牛乳房炎不仅造成产奶量下降，甚至严重影响牛奶品质，导致乳品工业的经济损失。S.aureus黏附到乳头管被认为是乳腺感染的第一步，因此，黏附到乳腺上皮细胞和细胞外基质上的能力对于S.aureus的致病性至关重要。S.aureus黏附的过程中有多种黏附因子参与，其中纤维素结合蛋白B(Fibronectin-bindingproteinB，简称FnbpB)是重要的黏附素之一，它能够介导S.aureus结合于细胞表面的纤维连结素(Fn)与纤维蛋白原(Fg)，使细胞黏附于宿主细胞表面，促进细菌对宿主的侵入。因此，目前研究表明以FnbpB为靶位进行疫苗的研制可能是预防奶牛S.aureus乳房炎的有效方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种金黄色葡萄球菌黏附素蛋白抗体的抗黏附能力的检测方法，通过将S.aureus菌株的FnbpB基因进行克隆表达后，再对表达产物的特异性抗体的抗黏附能力进行检测，进而为以FnbpB为靶位的S.aureus的黏附素疫苗提供参考，还为金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎疫苗的研究提供试验依据。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：金黄色葡萄球菌黏附素蛋白抗体的抗黏附能力的检测方法，包括以下步骤：(1)pET-FnbpB-D的诱导表达首先采用PCR方法对金黄色葡萄球菌FnbpB基因中的D区进行特异性的扩增得到构建的重组质粒，并利用表达载体pET-32a对该构建的重组质粒进行诱导表达后，经鉴定，诱导表达后的重组质粒以可溶性蛋白形式存在，然后将该可溶性蛋白形式的重组质粒进行大量表达纯化，得到目的蛋白；(2)目的蛋白免疫实验兔后的抗血清制备将目的蛋白与弗氏完全佐剂乳化后，实验兔背部多点注射免疫，注射量为600μg/只，2周后，将目的蛋白与弗氏不完全佐剂乳化后，进行加强免疫；1周后，实验兔耳缘静脉采血后，制备得到含有抗体的抗血清；(3)抗体抗黏附能力的检测，包括以下步骤：①5μg/mL牛纤维蛋白原包被酶标板，4℃过夜；②往酶标板中加入5％脱脂乳作为封闭液，37℃封闭3h得到封闭好的酶标板；③将对数生长期的S.aureus与制备的抗血清在37℃共孵育60min；④将孵育的S.aureus加入封闭好的酶标板中，以未经抗血清孵育的S.aureus做对照，37℃作用2h，PBST洗涤3次；⑤25％甲醛固定30min，洗涤同上；⑥用结晶紫染色30min，洗涤同上；⑦最后用95％乙醇脱色两次，每次5min，尽量使结晶紫全部脱出；⑧在波长405nm处测定经抗血清孵育的S.aureus、未经抗血清孵育的S.aureus两组的OD值；根据测定值，计算经抗血清孵育的S.aureus、未经抗血清孵育的S.aureus两组的平均OD405nm值以及标准差，从而对抗体的抗黏附能力进行判定。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术通过将S.aureus菌株的FnbpB基因进行克隆表达后，再对表达产物的特异性抗体的抗黏附能力进行检测，进而为以FnbpB为靶位的S.aureus的黏附素疫苗提供参考。本专利技术还为金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎疫苗的研究提供试验依据。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术实施例中，金黄色葡萄球菌黏附素蛋白抗体的抗黏附能力的检测方法，具体操作步骤如下：1、pET-FnbpB-D的诱导表达首先采用PCR方法对金黄色葡萄球菌FnbpB基因中的D区进行特异性的扩增得到构建的重组质粒，并利用表达载体pET-32a对该构建的重组质粒进行诱导表达后，经鉴定，诱导表达后的重组质粒以可溶性蛋白形式存在，然后将该可溶性蛋白形式的重组质粒进行大量表达纯化，得到目的蛋白。2、目的蛋白免疫实验兔后的抗血清制备将目的蛋白与弗氏完全佐剂乳化后，实验兔背部多点注射免疫(600μg/只)，2周后，将目的蛋白与弗氏不完全佐剂乳化后，进行加强免疫。1周后，实验兔耳缘静脉采血后，制备得到含有抗体的抗血清。3、抗体抗黏附能力的检测①5μg/mL牛纤维蛋白原包被酶标板，4℃过夜；②往酶标板中加入5％脱脂乳作为封闭液，37℃封闭3h得到封闭好的酶标板；③将对数生长期的S.aureus与制备的抗血清在37℃共孵育60min；④将孵育的S.aureus加入封闭好的酶标板中，以未经抗血清孵育的S.aureus做对照，37℃作用2h，PBST洗涤3次；⑤25％甲醛固定30min，洗涤同上；⑥用结晶紫染色30min，洗涤同上；⑦最后用95％乙醇脱色两次，每次5min，尽量使结晶紫全部脱出；⑧在波长405nm处测定OD值。4、抗体抗黏附能力的检测结果用酶标仪测定OD405nm，并从统计学角度来计算经抗血清孵育的S.aureus、未经抗血清孵育的S.aureus两组的平均OD405nm值以及标准差，结果表明：经抗血清孵育的S.arreus的平均OD405nm值为0.1679(标准差为0.0346)，未经抗血清孵育的S.aureus的平均OD405nm值为0.3543(标准差为0.0895)，经抗血清孵育的S.aureus的平均OD405nm值明显低于未经抗血清孵育的S.aureus，试验组与对照组差异极显著(p＜0.01)，表明抗血清有抑制S.aureus黏附到纤维连结素的作用。因此，通过上述方法，可以有效地检测金黄色葡萄球菌黏附素蛋白抗血清的抗黏附能力，为进一步证明FnbpB基因具有帮助S.aureus黏附于宿主细胞的作用，对金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎疫苗的研究提供了依据。对于本领域技术人员而言，显然本专利技术不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本专利技术的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本专利技术。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本专利技术的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本专利技术内。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。本文档来自技高网...

【技术保护点】
金黄色葡萄球菌黏附素蛋白抗体的抗黏附能力的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)pET‑FnbpB‑D的诱导表达首先采用PCR方法对金黄色葡萄球菌FnbpB基因中的D区进行特异性的扩增得到构建的重组质粒，并利用表达载体pET‑32a对该构建的重组质粒进行诱导表达后，经鉴定，诱导表达后的重组质粒以可溶性蛋白形式存在，然后将该可溶性蛋白形式的重组质粒进行大量表达纯化，得到目的蛋白；(2)目的蛋白免疫实验兔后的抗血清制备将目的蛋白与弗氏完全佐剂乳化后，实验兔背部多点注射免疫，注射量为600μg/只，2周后，将目的蛋白与弗氏不完全佐剂乳化后，进行加强免疫；1周后，实验兔耳缘静脉采血后，制备得到含有抗体的抗血清；(3)抗体抗黏附能力的检测，包括以下步骤：①5μg/mL牛纤维蛋白原包被酶标板，4℃过夜；②往酶标板中加入5％脱脂乳作为封闭液，37℃封闭3h得到封闭好的酶标板；③将对数生长期的S.aureus与制备的抗血清在37℃共孵育60min；④将孵育的S.aureus加入封闭好的酶标板中，以未经抗血清孵育的S.aureus做对照，37℃作用2h，PBST洗涤3次；⑤25％甲醛固定30min，洗涤同上；⑥用结晶紫染色30min，洗涤同上；⑦最后用95％乙醇脱色两次，每次5min；⑧在波长405nm处测定经抗血清孵育的S.aureus、未经抗血清孵育的S.aureus两组的OD值；根据测定值，计算经抗血清孵育的S.aureus、未经抗血清孵育的S.aureus两组的平均OD...

【技术特征摘要】
1.金黄色葡萄球菌黏附素蛋白抗体的抗黏附能力的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)pET-FnbpB-D的诱导表达首先采用PCR方法对金黄色葡萄球菌FnbpB基因中的D区进行特异性的扩增得到构建的重组质粒，并利用表达载体pET-32a对该构建的重组质粒进行诱导表达后，经鉴定，诱导表达后的重组质粒以可溶性蛋白形式存在，然后将该可溶性蛋白形式的重组质粒进行大量表达纯化，得到目的蛋白；(2)目的蛋白免疫实验兔后的抗血清制备将目的蛋白与弗氏完全佐剂乳化后，实验兔背部多点注射免疫，注射量为600μg/只，2周后，将目的蛋白与弗氏不完全佐剂乳化后，进行加强免疫；1周后，实验兔耳缘静脉采血后，制备得到含有抗体的抗血清；(3)抗体抗黏附能力的检测，包括以下步骤：①5μg/m...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝永清，
申请(专利权)人：中创云牧内蒙古科技咨询有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15