一种基于核磁共振技术判别大豆种子活力的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于核磁共振技术判别大豆种子活力的方法，其采用核磁共振波谱技术对大豆种子提取物中的代谢物进行绝对定量分析，得到代谢物归属图谱，并基于建立的偏最小二乘法多元回归模型，筛选特定代谢物，继而利用得到的大豆种子中特定代谢物的绝对含量值判别其活力高低，为大豆种子活力判别及抗老化大豆种质资源的筛选提供参考。本发明专利技术操作简单快速、结果可靠，可为具有抗老化潜力的优质大豆种质资源的判定和筛选提供参考。

Method for distinguishing soybean seed vigor based on nuclear magnetic resonance technique

The invention discloses a method for magnetic resonance technique to determine the seed vigor of soybean based on the NMR absolute quantitative analysis of soybean seed extract metabolites, metabolites and get ownership patterns, based on partial least squares regression model, screening of specific metabolites, and then use the absolute content of soybean seeds the specific values of metabolites to judge its viability, to provide reference for the screening of discrimination of soybean seed vigor and aging of soybean germplasm resources. The invention has the advantages of simple operation, fast speed and reliable result, and can provide reference for the determination and screening of high quality soybean germplasm resources with anti-aging potential.

【技术实现步骤摘要】
一种基于核磁共振技术判别大豆种子活力的方法
本专利技术属于分析化学
，更具体地讲，涉及一种基于核磁共振波谱技术的代谢组学技术判别大豆种子活力的方法。
技术介绍
种子在储藏过程中均会发生不同程度的老化，并直接导致种子活力降低，抑制种胚正常发育以及幼苗生长，由此造成植物生产水平与品质的大幅下降。因此，农业生产前必须对种子活力进行检测，保证采用高活力的种子进行播种，减少因种子失活带来的生产损失。以抗老化优质大豆品种的选育为例：种子在生物多样性保护、农林牧业生产和植物群落重建、演替中具有举足轻重的作用。一般来讲，具有正常生理活性的种子能够在干燥条件下保持一定时间的活力，但随着贮存时间的延长，种子劣变老化将不可逆、不可避免地发生，其品质的优劣直接影响了农作物、饲草、林木等的生产、经济与遗传资源有效利用、土壤种子库稳态维持。抗老化大豆品种的选育迫在眉睫。抗老化大豆品种的评价，多通过检测种子活力判断，常规方法有籽粒的萌发实验、生理测定、加速老化法、电导率测定法和生化测定法等，这些方法都具有周期长、用量大的缺点，还存在人为等不稳定因素对最终结果的干扰，导致评价耗时费力，尤其是对于稀有供试材料的活力判别，难以快速达到预期目的，因此，实践中亟需一种快速的、准确的，不易受外界不定因素干扰的种子活力检测方法。定量核磁共振技术是一种可以通过准确定量代谢物的绝对浓度值来获得种子内部信息的一项技术。与传统鉴别种子活力的方法相比，该技术前处理简便，可通过核磁共振波谱技术实现对待测大豆籽粒中各代谢物的全面分析。结合统计分析法，找出种子活力差异显著的大豆籽粒中各表征代谢物，并建立可行性强，准确度高的判别模型，可为种子活力的判别提供强有力的技术支撑。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种基于核磁共振手段判别不同大豆种子活力的方法。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案实现的：一种基于核磁共振手段判别不同大豆种子活力的方法，通过核磁共振波谱技术检测大豆种子中多种代谢物的绝对含量，并筛选出对大豆种子活力影响显著的一种或多种代谢物，建立所述一种或多种对大豆种子活力影响显著的代谢物与大豆种子活力之间的关联，检测待测大豆种子中所述一种或多种对大豆种子活力影响显著的代谢物的绝对含量并根据所述关联判别待测大豆种子的活力。根据本专利技术的一些实施例，所述对大豆种子活力影响显著的一种或多种代谢物包括：精氨酸、色氨酸、次黄嘌呤、异丙醇、丙二醇、磷酸胆碱、丙三醇磷酸胆碱和二甲基尿酸盐。本专利技术的优选方法筛选出8种对大豆种子活力影响显著的代谢物，并用同品种不同年份的大豆种子对这些代谢物进行t检验，不同年份大豆种子之间差异显著，证明这8种代谢物能够很好的表征大豆种子的活力。将这些代谢物与大豆种子活力建立关联，根据本专利技术的一些实施例证实，建立的关联模型能简便、准确的判别大豆种子活力。因而，利用本专利技术的方法，一旦建立模型，每次只需要检测大豆种子中上述8种代谢物的绝对含量，代入关联模型，即可获得种子活力结果。不需要检测所有代谢物含量，也不需要耗时较长的萌芽实验或酶活性检测实验。根据本专利技术的一些实施例，所述通过核磁共振波谱技术检测大豆种子中多种代谢物的绝对含量的步骤，包括大豆种子提取液的制备和核磁共振分析，并以DSS-d6的浓度和峰面积为标准，根据大豆种子提取液的分析图谱获得大豆种子中多种代谢物的绝对含量。作为优选，所述通过核磁共振波谱技术检测大豆种子中多种代谢物的绝对含量的步骤具体包括：a、将待测大豆种子样本液氮研磨后得到豆粉，(将所述豆粉储存于-80～-70℃的环境下备用)取所述豆粉置于冷冻干燥机中干燥，再称取豆粉置于样本管中，加入甲醇水溶液，密封震荡后进行冰水浴超声提取，离心后取上清液并将上清液氮吹、冻干，复溶后将所得样品在-80～-70℃下保存待测；b、对样品进行1H-NMR分析，获得所述待测大豆种子样本的核磁共振分析谱图，即为所述大豆代谢物靶向代谢图谱；c、以DSS-d6(sodium4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonate-d6，氘代4,4-二甲基-4-硅戊烷-1-磺酸)的浓度和峰面积为标准，根据步骤b的分析图谱获得大豆种子中多种代谢物的绝对含量。其中，在本专利技术的一些实施例中，步骤c利用所述分析图谱计算得到各种代谢物的绝对含量的步骤包括以下子步骤：将1H-NMR自由感应衰减(freeinductiondecay,FID)信号导入到ChenomxNMRsuit(version8.0,Chenomx,Edmonton,Canada)软件中，自动进行傅立叶转换，调整相位，校正基线。以DSS-d6峰(0.0ppm)作为全部谱图化学位移的标准，并对其进行反转卷积操作，调整谱图峰形(CSI)。根据1H-NMR谱图中信号的相关信息(如化学位移、峰形、半峰宽、耦合裂分等)，以DSS-d6的浓度和谱峰面积为标准，结合Chenomx自带数据库对样本谱图的信号逐一比对分析，获得代谢物的绝对浓度值。作为进一步的优选，在上述步骤b中，1H-NMR的具体参数条件包括：采用metnoesy脉冲序列，频率内锁为氘代甲醇，测定温度25℃，观察频率599.83MHz，谱宽7225.434Hz，采样时间4.089s，脉冲延缓时间4s，扫描次数128，脉冲宽度8.97μs，采集数据点65536。根据本专利技术的一些实施例，步骤c检测的大豆种子中多种代谢物包括12个有机酸(羟基异丁酸、氨基丁酸、羟基苯丙氨酸、醋酸盐、柠檬酸盐、甲酸盐、延胡索酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、葡萄糖酸、丙二酸盐、琥珀酸盐)，2个糖类(粘酸、蔗糖)，15个氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甜菜碱、谷氨酸盐、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、葫芦巴碱、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、谷酰基苯丙氨酸、甲基组氨酸)，4个核酸类(腺嘌呤、腺苷、次黄嘌呤、尿苷)及10个其它类别的化合物，共计43种代谢物。根据本专利技术的一些实施例，所述筛选出对大豆种子活力影响显著的一种或多种代谢物的步骤，包括：i、将检测得到的大豆种子中多种代谢物的绝对含量形成一个变量矩阵；ii、将步骤i所述矩阵中的变量进行标度化后利用正交偏最小二乘-判别分析方法对数据矩阵进行统计分析，筛选对分类有重要贡献的代谢物；iii、对步骤ii筛选出的代谢物进行t检验，结合实际检测种子活力表型选出含量差异显著的代谢物，并将其作为对大豆种子活力影响显著的一种或多种代谢物。根据本专利技术的一些实施例，对大豆种子活力影响显著的代谢物为8种：精氨酸、色氨酸、次黄嘌呤、异丙醇、丙二醇、磷酸胆碱、丙三醇磷酸胆碱和二甲基尿酸盐。建立对大豆种子活力影响显著的代谢物与大豆种子活力之间的关联的步骤，包括将对大豆种子活力影响显著的一种或多种代谢物及其含量的原始数据信息导入到SPSS，利用Fisher判别法建立高活力种子、中活力种子、低活力种子的判别模型。根据本专利技术的一个实施例，根据现有的大豆种子样本信息将所述对大豆种子活力影响显著的代谢物及其绝对含量与大豆种子活力建立关联，形成判别标准，其中高活力种子、中活力种子、低活力种子的判别模型如下：y1＝1490.702X1+5812.922X2-4900.809X3+140324.202X4+83872.242X5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于核磁共振技术判别大豆种子活力的方法，其特征在于，通过核磁共振波谱技术检测大豆种子中多种代谢物的绝对含量，并筛选出对大豆种子活力影响显著的一种或多种代谢物，建立所述一种或多种对大豆种子活力影响显著的代谢物与大豆种子活力之间的关联，检测待测大豆种子中所述一种或多种对大豆种子活力影响显著的代谢物的绝对含量并根据所述关联判别待测大豆种子的活力。

【技术特征摘要】
1.一种基于核磁共振技术判别大豆种子活力的方法，其特征在于，通过核磁共振波谱技术检测大豆种子中多种代谢物的绝对含量，并筛选出对大豆种子活力影响显著的一种或多种代谢物，建立所述一种或多种对大豆种子活力影响显著的代谢物与大豆种子活力之间的关联，检测待测大豆种子中所述一种或多种对大豆种子活力影响显著的代谢物的绝对含量并根据所述关联判别待测大豆种子的活力。2.根据权利要求1所述的基于核磁共振技术判别大豆种子活力的方法，其特征在于，所述对大豆种子活力影响显著的一种或多种代谢物包括：精氨酸、色氨酸、次黄嘌呤、异丙醇、丙二醇、磷酸胆碱、丙三醇磷酸胆碱和二甲基尿酸盐。3.根据权利要求1所述的基于核磁共振技术判别大豆种子活力的方法，其特征在于，所述通过核磁共振波谱技术检测大豆种子中多种代谢物的绝对含量的步骤，包括大豆种子提取液的制备和核磁共振分析，并以DSS-d6的浓度和峰面积为标准，根据大豆种子提取液的分析图谱获得大豆种子中多种代谢物的绝对含量。4.根据权利要求3所述的基于核磁共振技术判别大豆种子活力的方法，其特征在于，所述通过核磁共振波谱技术检测大豆种子中多种代谢物的绝对含量的步骤具体包括：a、将待测大豆种子样本液氮研磨后得到豆粉，取所述豆粉置于冷冻干燥机中干燥，再称取豆粉置于样本管中，加入甲醇水溶液，密封震荡后进行冰水浴超声提取，离心后取上清液并将上清液氮吹、冻干，复溶后将所得样品在-80℃下保存待测；b、对样品进行1H-NMR分析，获得所述待测大豆种子样本的核磁共振分析谱图；c、以DSS-d6的浓度和峰面积为标准，根据步骤b的分析图谱获得大豆种子中多种代谢物的绝对含量。5.根据权利要求4所述的基于核磁共振技术判别大豆种子活力的方法，其特征在于，在步骤b中，1H-NMR的具体参数条件包括：采用metnoesy脉冲序列，频率内锁为氘代甲醇，测定温度25℃，观察频率599.83MHz，谱宽7225.434Hz，采样时间4.089s，脉冲延缓时间4s，扫描次数128，脉冲宽度8.97μs，采集数据点65536。6.根据权利要求1所述的基于核磁共振技术判别大豆种子活力的方法，其特征在于，所述筛选出对大豆种子活力影响显著的一种或多种代谢物的步骤，包括：i、将检测得到的大豆种子中多种代谢物的绝对含量形成一个变量矩阵；ii、将步骤i所述矩阵中的变量进行标度化后利用利用主成份分析和正交偏最小二乘-判别分析方法对数...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘江，秦雯婷，杨才琼，胡宝予，邓俊才，张潇文，张静，杨文钰，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51