抗CD20四价抗体、其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了抗ＣＤ２０四价抗体、其制备方法和应用，更具体地，本发明专利技术公开了抗ＣＤ２０四价抗体Ｃ２Ｂ８（ＳｃＦｖＨＬ）↓［４］－Ｆｃ、２Ｆ２（ＳｃＦｖＨＬ）↓［４］－Ｆｃ，其制备方法和其在制备抗Ｂ细胞淋巴瘤的药物中的用途。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及抗体领域，更具体地，本专利技术公开了一种抗四价抗体、其制备 方法和其在制备抗B细胞淋巴瘤药物方法的用途。
技术介绍
恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病，在各种疾病所致死亡中高 居第二位。非霍奇金淋巴瘤(Non Hodgkin， s ly即homa ， NHL)是临床最常见 的淋巴系统恶性肿瘤，其中B细胞来源的约占85。/。，好发于青壮年，发病率和病 死率呈逐年上升趋势。根据病情特点，NHL可分为低、中、高三度。其中低度 和部分中度NHL病程进展缓慢，统称为惰性NHL。它们对首次化疗敏感,但很容 易复发或耐药，当再次化疗或放疗时，疗效明显降低，因而被认为是难以治愈 的恶性肿瘤。近年来，单克隆抗体及其导向治疗NHL的临床试验研究取得了重 大进展，其中被广泛使用且富有成效的是抗CD20的单抗制剂。CD20抗原是一 种B细胞分化抗原，仅位于前B细胞和成熟B细胞，它在95 。/。以上的B细胞性 淋巴瘤中表达，且表面密度很高，而在造血干细胞、血浆细胞和其他正常组织 中不表达。更为重要的是，CD20分子在与单克隆抗体结合后，无显著内化及脱 落，故成为治疗B细胞淋巴瘤的理想靶点。目前采用抗CD20抗体治疗非霍奇金淋巴瘤已取得了较好的疗效。Rituxan(Rituximab， C2B8)为美国基因科技公司研制的以CD20为耙点的单克隆 抗体，它是一种人鼠嵌合基因工程抗体，包含了鼠单克隆抗体的可变区基因和 人抗体的恒定区基因。 Rituxan已于1997年11月获FDA的批准上市，用于复 发性或顽固性低度或滤泡性非霍奇金淋巴瘤的临床治疗。尽管C2B8抗体在临床治疗中已显示出较好的疗效，仍有52% 的病人对C2B8治疗不产生反应。因此，寻求更为有效用于治疗B淋巴瘤的CD20 抗体药物显得尤为迫切。已有许多相关的研究阐述了抗CD20单克隆抗体可能的作用机制，主要包括 补体介导的细胞溶解作用(CDC作用)，抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC) 和对肿瘤细胞的诱导凋亡作用(Ap叩tosis)及生长抑制作用。而对于抗CD20 抗体主要通过其中何种机制发挥抗肿瘤作用仍存在争论中。可是，目前变得越 来越清楚的是，这些机制不是互相孤立地、而是互相协同地发生作用。因此 我们推测，对于C2B8抗体治疗不敏感的病人或许会对其它类型和结构的、发挥 不同生物学功能的抗CD20抗体产生反应。抗CD20抗体根据其体外生物学功能 的不同可以分为两型I型CD20抗体包括C2B8和其它大部分CD20抗体，主要 通过CDC功能发挥作用而凋亡作用很弱；而II型CD20抗体包括Bl和11B8，主要通过凋亡发挥作用而CDC功能很弱。除了 I型抗体C2B8获批准用于临床治疗 以外，II型抗体Bl与mI偶联制备的标记抗体药物Tositumomab也已获得批准 用于非霍奇金氏淋巴瘤的治疗。更为重要的是，临床前试验已经表明11B8的裸 抗体同'"工标记的11B8抗体同样有效。因此，由于这两型抗体具有 明显不同的生物学活性，对于I型抗体治疗不敏感的病人很可能将会对II型的 治疗产生反应，而反之亦然。由此，我们想到，如果一种抗体既有很强的CDC 作用又具备很强的诱导凋亡的能力，它或许可以更为有效的杀伤CD20+肿瘤细胞。 经二抗交联后的CD20抗体具有明显增强的诱CD20+细胞凋亡的作用,因为这种方法用于休内治 疗则不可行，因而人们继续致力于制备新型有效的抗体分子。研究表明，成为 二聚体形式的抗体，其凋亡作用和生长抑制作用均可明显增强。 但是，通过化学交联法产生二聚体的方式存在很多缺陷，主要是二聚体抗体的 分子量大(300kDa)和半衰期短[Wolff EA， Schreiber G丄Cosand WL, Raff HV. Monoclonal antibody homodimers: enhanced antitumor activity in nude mice. Cancer Res. 1993:53:2560—2565.Ghetie MA， Podar EM， IlgenA， Gordon BE,Uhr JW， Vitetta ES. Homodimerization of tumor—reactive monoclonal antibodies markedly increases their ability to induce growth arrest or apoptosis of tumor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 1997:94:7509-7514.]。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术的申请人进行了大量的实验，采用基因工程技 术构建了两种I型抗体C2B8和2F2的四价基因工程抗体，2F2是一种全人源抗 CD20单克隆抗体，其CDC作用强于C2B8抗体。本专利技术公开的四价抗CD20抗体 和原亲本抗体都可以与Raji细胞特异性结合，而且其相对亲和力相似，但本发 明公开的四价抗CD20抗体有更强的凋亡诱导作用和生长抑制功能，并具有能显 著提高荷瘤小鼠的生存率的优点。实验结果表明，本专利技术公开的四价抗体虽然具有四个抗原结合位点，构建 的四价抗体的分子量只比亲本两价抗体大25KDa，其在小鼠体内的血浆半衰期 稍长于亲本二价抗体，表明这种四价抗体的结构高度稳定；本专利技术的申请人进 而通过体内外试验比较四价抗体和原亲本二价抗体的抗肿瘤活性，研究结果表明，2F2的四价抗体 2F2(ScFvHL)4-Fc不仅具有与其亲本两价抗体2F2相同的CDC和ADCC活性，而且在促肿瘤细胞凋亡和生长抑制功能上较原二价抗体均有明显增强，甚至强于 C2B8的四价抗体C2B8(ScFvHL)4-Fc。体内免疫治疗实验更进一步证实，四价抗 体2F2(ScFVHL)4-Fc在延长荷瘤SCID小鼠的生存期上明显强于其它三种抗体，可以成为B淋巴瘤的治疗提供新型抗体药物。利用基因工程技术构建了四价抗CD20抗体，本专利技术公开了-1， 一种抗CD20四价抗体；2， 卜.述1所述的抗CD20四价抗体为C2B8(ScFvHL)厂Fc;3， 上述2的抗CD20四价抗体，其氨基酸序列为SEQ ID NO: 18;4， 编码上述3所述抗体的核苷酸序列，为SEQ ID NO: 17;5， 上述1所述的抗CD20四价抗体为2F2(ScFvHL)4-Fc;6， 上述5所述的抗CD20四价抗体，其氨基酸序列为SEQ ID N0:20;7， 编码上述6所述抗体的核苷酸序列，为SEQ ID N0:198， 制备上述的抗CD20四价抗体的方法，包括a. 构建CD20单抗c2B8或2F2的单链抗体ScFv并克隆获得人抗体 IgGlFc基因；b. 将2个相同的单链抗体基因串联连接后再与人抗体Fc段基因相连 得到融合基因；c. 将上述融合基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)，构建成真核表 达载体pcDNA3.1 (C2B8(ScFvHL)2Fc)或pcDNA3.1 (2F2(ScFvHL)2Fc);d. 表达载体 pcDNA3.1 (C2B8(ScFvHL)2Fc) 或 pcDNA3.1 (2F2(ScFvHL)2Fc)转染CHO细胞，筛选，进行亚克隆，将筛本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗ＣＤ２０四价抗体。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭亚军，李博华，张大鹏，钱卫珠，侯盛，王皓，
申请(专利权)人：上海中信国健药业有限公司，上海国健生物技术研究院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]