利用非天然编码氨基酸的生物合成多肽制造技术

本发明专利技术提供经修饰生物合成多肽分子、其制造方法和用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及生物合成多肽，和包含至少一个非天然编码氨基酸或由至少一个非天然 编码氨基酸制成的融合蛋白。
技术介绍
肽广泛用于研究和医学实践，并且可以预期其重要性将随肽产品的制造和性能所提 出的挑战而增加。例如本文所述的治疗肽被称为生物合成多肽(BSP)。许多内源肽已描 述成生物过程的关键组分。这些肽中的一些已被鉴别为用于控制各种病症的治疗剂。--般来说，内源肽比具有非天然序列的合成肽更适合用作治疗剂，因为由于其内源特征而 不产生免疫应答。此外，内源肽高度特异于其靶受体并且易于合成和制造。然而，传送 所述治疗肽的主要困难在于其较短的血桨半衰期，这主要是由于快速血清清除和经由肽 酶作用的蛋白水解降解。当将天然肽或其类似物用于治疗中时，通常发现其具有高降解率和/或清除率。当需 要维持长期高血液含量时，高清除率治疗剂是不便利的，因为随后必需重复投药。具有 高降解率和/或清除率的肽的实例包括ACTH、促肾上腺皮质激素释放因子、血管紧张 素、降钙素(calcitonin)、胰岛素、胰高血糖素(glucagon)、胰高血糖素样肽1、胰高 血糖素样肽2、胰岛素样生长因子l、胰岛素样生长因子2、胃抑制肽、生长激素释放因 子、垂体月泉苷酸环化酶激活月太(pituitary adenylating cyclase activating peptide)、肠泌素、 肠促胃泌素(enterogastrin)、生长抑素(somatostatin)、生长激素、生长调节素、甲状旁 腺激素、血栓形成素、红细胞生成素、下丘脑释放因子、催乳素(prolactm)、促甲状腺激素、内啡肽(endorphin)、脑啡肽(enkephalin)、血管加压素(vasopressin)、縮宫素 (oxytocin)、阿片样物质及其类似物、超氧化物歧化酶、干扰素、天冬酰胺酶、精氨酸 酶、精氨酸脱氨酶、腺苷脱氨酶和核糖核酸酶。在一些情况下，能够通过应用合适医药 组合物影响肽的释放曲线，但是此方法具有多种缺点并且通常不适用。肽酶通过跨肽键插入水分子来破坏肽中的肽键。 一般来说，通过体内的肽酶以数分 钟或更短的方式破坏大部分肽。此外， 一些肽酶对某些类型肽具有特异性，使得其降解 更为快速。因此，如果将肽用作治疗剂，那么由于肽酶的作用肽活性通常随体内肽的快 速降解而降低。一种克服所述不利之处的方法在于对患者投与大剂量的令人感兴趣的治疗肽，使得 即使一些肽降解，还仍然能够保留足够的治疗有效性。然而，此方法对于患者来说相当 不方便。由于大部分治疗肽不能口服投与，因此治疗肽不得不不断地灌输，通过静脉内 注射频繁投与，或通过不便的皮下注射途径频繁投与。对于许多潜在的肽治疗法而言， 对频繁投药的需要也产生每个治疗疗程不可接受的高预计费用。大量降解肽的存在还可 能产生不良副作用。投药不便和高花费是具有吸引力的生物活性特征的治疗肽为何并未开发成候选药 物的两个原因。而是，这些治疗肽用作开发肽模拟化合物的模板以取代治疗肽。生物技 术和大医药公司通常进行长期和昂贵的优化程序以试图丌发出非肽、有机化合物来模拟 利用治疗肽所见的活性而不发生不可接受的副作用。举例来说，由昂贵SAR(结构一活 性关系(Structure Activity Relationship))和分子模拟研究所产生的环状肽、肽模拟物和 小分子已经致使开发出可惊人的肽模拟物。然而，这些肽模拟物决不反映治疗肽确切的 原始生物学性质，并且因此次于作为治疗剂的内源治疗肽。产生肽模拟物的替代是阻断肽酶作用从而阻止治疗肽的降解，或者修饰治疗肽使得 减缓其降解而同时保留生物活性。所述方法包括与例如葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、糖肽、 聚乙二醇和聚氨基酸的聚合物质结合，与硫酸adrcntm结合，以及与多糖、低分子量化 合物(例如氨基卵磷脂(aminolethicm))、脂肪酸、维生素B12和糖苷结合。 一些方法 包括与载体蛋白活体外结合。需要对治疗肽加以改进，致使阻止由添加聚合物质所引起 的随机结合物产生和/或治疗活性降低。因此需要经保护以免于肽酶活性并且具有较长活 体内作用持续时间并同时维持低毒性但仍保留修饰肽的治疗优势的改进治疗肽。共价连接亲水性聚合物聚(乙二醇)(简称为PEG)是一种增加水溶性、生物利用率，增加血清半衰期，增加治疗半衰期，调节免疫原性，调节生物活性或延长许多生物活性分子(包括蛋白、肽和特定疏水性分子)循环吋间的方法。PEG已经广泛用于医药品、人工移植体和其它应用中，在这些应用中生物相容性、缺乏毒性和缺乏免疫原性是 重要的。为了将PEG的所需特性最大化，连接于生物活性分子的PEG聚合物的总分子 量和水合状态必须足够高以能够赋予通常与PEG聚合物连接相关的有利特征(例如增加 水溶性和增加循环半衰期)，而不会不利地影响母体分子的生物活性。PEG衍生物通常经例如赖氨酸、半胱氨酸和组氨酸残基、N端和碳水化合物部分的 反应性化学官能团与生物活性分子相连接。蛋白与其它分子通常具有有限数目的可用于 聚合物连接的反应性位点。最适合于经聚合物连接而进行修饰的位点通常在受体结合中 起重要作用，并且是要保留分子的生物活性所必需的。因此，聚合物链与生物活性分子 上这些反应性位点的不加选择的连接通常导致经聚合物修饰的分子的生物活性显著降 低或甚至完全丧失。R. Clark等人，(1996), J. Biol. Chem.， 271:21969-21977。为了形成具 有足以对靶分子赋予所需优势的聚合物分子量的结合物，先前技术方法通常涉及许多聚 合物臂与分子的随机连接，因而增加了母体分子生物活性降低或甚至完全丧失的风险。形成用于PEG衍生物与蛋白连接的基因座的反应性位点由蛋白结构决定。包括酶在 内的蛋白由各种a氨基酸序列组成，其具有一般结构H2N--CHR--COOH。 一个氨基酸的 a氨基部分(H2N--)结合邻近氨基酸的羧基部分(--COOH)以形成酰胺键，可由 —(NH—CHR—CO)n--表示，其中下标"n"可以等于数百或数千。由R所示的片段可以 含有用于蛋白生物活性和用于PEG衍生物连接的反应性位点。举例来说，在氨基酸赖氨酸的情况下，在e位以及a位存在-NH2部分。f位-NH2 部分对于在碱性pH条件下的反应而言是游离的。大部分用PEG进行蛋白衍生化的领域 的技术已经针对于开发PEG衍生物来用于连接存在于蛋白中的赖氨酸残基的e位-NH2 咅卩分。"Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation", Nektar.Molecular Engineering Catalog, 2003,第1-17页。所有这些PEG衍生物均具有一般限制，然而它们 不能够被选择性地安置于蛋白表面上所存在的许多赖氨酸残基中。在赖氨酸残基对于蛋 白活性是重要的情况下，例如存在于酶活性位点中，或者在赖氨酸残基对介导蛋白与其 它生物分子互作起作用的情况下，如在受体结合位点的情况下，这会是一个显著限制。现有蛋白PEG化方法的第二个且等同重要的复杂因素在于PEG衍生物还会与所需 残基之外的残基发生不良副反应。组氨酸含有由结构--N(H)--所示的反应性亚氨基部分， 但是许多与￡位本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包含下式的多肽：　　　　（ＬＴ）－Ｐ－Ｔ′，　　　　其中（ＬＴ）是选自由以下各物组成的群组：定位肽（Ｌ）、标签或连接子（Ｔ）、任何次序的定位肽（Ｌ）和标签或连接子（Ｔ）、蛋氨酸和不存在；　　　　Ｐ包含ＢＳＰ序列；且　　　　Ｔ′包含标签或连接子或不存在，　　　　其中所述Ｌ、Ｔ、Ｐ或Ｔ′包含一个或一个以上非天然编码氨基酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：霍松丘，托马斯O丹尼尔，安娜玛丽亚艾，特洛伊E威尔逊，戴维C利青格，罗伯特玛丽安妮，布鲁斯E基梅尔，威廉M基弗，
申请(专利权)人：AMBRX公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]