一种RT‑LAMP核酸试纸条试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种RT‑LAMP核酸试纸条试剂盒及应用，其中，核酸试纸条试剂盒包括：引物组、核酸检测试纸条、硫酸镁、甜菜碱、dNTPs、AMV反转录酶、Bst聚合酶、缓冲液、RNA模板。本发明专利技术采用RT‑LAMP技术与核酸试纸条检测技术相结合的方法，能够利用简单的实验仪器、快速高效的对新型鸭呼肠孤病毒进行检测，解决了RT‑LAMP产物检测中的假阳性问题，不仅方便快捷，特异性强，且敏感性比常规RT‑PCR高约100倍，有利于核酸试纸条方法的推广应用，能满足临床及现场快速检测需要。

A RT LAMP nucleic acid strip kit and Application

The invention discloses a RT LAMP nucleic acid strip kit and application, wherein the nucleic acid strip kit includes: primer set, nucleic acid detection strip, Magnesium Sulfate, dNTPs, betaine, AMV reverse transcriptase, Bst polymerase, template buffer, RNA. The invention adopts the method of RT LAMP and nucleic acid strip detection technology combining the experimental instruments, can use simple fast and efficient model of duck reovirus were detected, to solve the problem of false positive detection of RT LAMP in the products, not only convenient, specificity and sensitivity than conventional RT PCR is about 100 times higher, and is favorable for promotion and application of nucleic acid test strip method, can meet the need of clinical and on-site rapid detection.

【技术实现步骤摘要】
一种RT-LAMP核酸试纸条试剂盒及应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种RT-LAMP核酸试纸条试剂盒及应用。
技术介绍
Glynou等通过在免疫层析试纸条的质控线与检测线上分别喷涂链霉亲和素和polyA，利用生物素-亲和素放大系统加快产物在固相载体膜上的反应，当标记有polyT的胶体金与带有polyA的扩增产物在试纸条上杂交时，大量胶体金颗粒富集在检测线处显色，即可用肉眼进行判读结果(Glynouetal,2003)。Cater等建立了核酸试纸条技术，并通过试验证明了这一技术具有较高的敏感性。通过核酸试纸条可在复杂的核酸混合物中检测到特定的分子标签，检测用量低至250Amol。这种核酸试纸条技术减少了传统检测中试剂的消耗和检测时间(Carteretal,2007)，有利于在基层检测中推广应用。新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)病，是由分节段的dsRNA病毒引起的，以肝脏不规则坏死，出血斑点和心肌，法氏囊出血为主要症状的新疫病。目前，对该病毒的检测方法有多种，但都存在一定的缺陷：如常规的血清学检测方法灵敏性不够高；聚合酶链式反应(PCR)法需要昂贵PCR仪器、操作条件苛刻且操作过程复杂，检测时间过长，不能满足现场及基层快速检测需要；现有新型鸭呼肠孤病毒的反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)快速检测方法极易出现假阳性问题。因此，现有技术还有待于改进和发展。
技术实现思路
鉴于上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种RT-LAMP核酸试纸条检测方法及应用，旨在解决现有的新型鸭呼肠孤病毒检测方法检测灵敏度不高，需要大型仪器且操作复杂以及检测结果易出现假阳性的问题。本专利技术的技术方案如下：一种RT-LAMP核酸试纸条试剂盒，其中，包括如下引物组和核酸检测试纸条:所述引物组的核苷酸序列如下所示：外引物：F3：5’-CGTGGATGGTCAAAGTCGT-3’；B3：5’-ACCTACACTCCAGGAAGGAC-3’；内引物：FIP：5-Biotin-TAGTTCTGGCATGGCCTCGC-CTTTACATGTGCTGCAGGGA-3’；BIP：5-Fitc-TGTTCGGACGTTCTCTTCCGGA-TTTAATGGCGCGGACGAC-3’；环引物：LoopF：5’-AGCCTAGATTCGCACTCCG-3’；LoopB：5’-CGAGGAGACTACCCACGTT-3’。所述的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒，其中，用生物素和荧光素对上述引物组中的引物进行标记。所述的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒，其中，还包括：硫酸镁、甜菜碱、dNTPs、AMV反转录酶、Bst聚合酶、缓冲液。所述的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒，其中，RT-LAMP反应的初始反应体系包括：浓度为100mmol/L的硫酸镁、浓度为5mmol/L的甜菜碱、浓度为2.5mmol/L的dNTPs、浓度为10U/μL的AMV反转录酶、浓度为8U/μL的Bst聚合酶、RNase-freewater的加入量为3.7μL、缓冲液的加入量为2.5μL、外引物的浓度为10μmol/L、环引物的浓度为10μmol/L、内引物的浓度为10μmol/L。所述的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒的应用，其中，包含以下步骤：(1)配置RT-LAMP反应体系：按终浓度计算，浓度为0～6mmol/L的硫酸镁、浓度为0～1.5mmol/L的甜菜碱、浓度为0.2～0.7mmol/L的dNTPs、浓度为0.06～0.16U/μL的AMV反转录酶、浓度为0.08～0.48U/μL的Bst聚合酶、RNase-freewater将反应体系的总体积补足至25μL、缓冲液的加入量为反应体系总体积的0～16％、内引物与外引物的终浓度比为2:1～12:1、环引物与外引物的终浓度比为0～6:1、待测样品RNA的加入量为2μL；(2)反应：将步骤(1)中的反应体系恒温反应，然后将反应后的产物用核酸检测试纸条检测，10～30min后读取检测结果；(3)检测结果判读：阴性：当核酸检测试纸条位于质控区的条带呈红色，检测区无条带时，则表明待测目标未被新型鸭呼肠孤病毒感染；阳性：当核酸检测试纸条出现分别位于质控区和检测区的两条红色条带时，则表明待测目标已被新型鸭呼肠孤病毒感染；无效：当核酸检测试纸条质控区和检测区均未出现条带时，则表明检测过程无效。所述的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒的应用，其中，步骤(1)中，内引物终浓度为2.0μmol/L，外引物终浓度为0.2μmol/L，环引物的终浓度为0.8μmol/L。所述的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒的应用，其中，步骤(1)中，硫酸镁的终浓度为3mmol/L、甜菜碱的终浓度为0.5mmol/L、dNTPs的终浓度为0.3mmol/L、AMV反转录酶的终浓度为0.14U/μL的、Bst聚合酶的终浓度为0.32U/μL。所述的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒的应用，其中，上述步骤(2)中的恒温反应的温度为59～66℃。所述的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒的应用，其中，上述步骤(2)中的恒温反应的时间为10～60min。所述的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒的应用，其中，上述步骤(2)中的恒温反应条件为65℃反应50min。有益效果：本专利技术提供了一种RT-LAMP核酸试纸条试剂盒及应用，通过在线引物设计软件设计和筛选出了一套特异性好的新型鸭呼肠孤病毒的RT-LAMP反应引物组，将该引物组应用在RT-LAMP反应中，并用核酸试纸条对RT-LAMP反应后的产物进行检测，该检测方法简单易行、检测结果的响应速度快、且检测灵敏度高，特异性好，能够有效避免假阳性检测结果的产生。附图说明图1为本专利技术酶切鉴定引物特异性检测结果图，其中：泳道M为2000bpDNAMarker、泳道1为酶切产物、泳道2为阳性、泳道3为ddH2O阴性得到的反应产物。图2为本专利技术RT-LAMP反应温度优化结果图，其中：泳道M为2000bpDNAMarker、泳道1～9分别为66℃、65℃、64℃、63℃、62℃、61℃、60℃、59℃、ddH2O阴性得到的反应产物。图3为本专利技术RT-LAMP反应时间优化结果图，其中：泳道M为2000bpDNAMarker、泳道1～7分别为10min、20min、30min、40min、50min、60min、ddH2O阴性得到的反应产物。图4为本专利技术RT-LAMP反应体系中硫酸镁浓度优化结果图，其中：泳道M为2000bpDNAMarker、泳道1～8分别为0mmol/L、1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L、6mmol/L、ddH2O阴性得到的反应产物。图5为本专利技术RT-LAMP反应体系中甜菜碱浓度优化结果图，其中：泳道M为2000bpDNAMarker、泳道1～5分别为0mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、ddH2O阴性得到的反应产物。图6为本专利技术RT-LAMP反应体系中dNTPs浓度优化结果图，其中：泳道M为2000bpDNAMarker、泳道1～7分别为0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种RT‑LAMP核酸试纸条试剂盒，其特征在于，包括如下引物组和核酸检测试纸条:所述引物组的核苷酸序列如下所示：外引物、F3：5’‑CGTGGATGGTCAAAGTCGT‑3’；B3：5’‑ACCTACACTCCAGGAAGGAC‑3’；内引物、FIP：5‑Biotin‑TAGTTCTGGCATGGCCTCGC‑CTTTACATGTGCTGC AGGGA‑3’；BIP：5‑Fitc‑TGTTCGGACGTTCTCTTCCGGA‑TTTAATGGCGCGGA CGAC‑3’；环引物、LoopF：5’‑AGCCTAGATTCGCACTCCG‑3’；LoopB：5’‑CGAGGAGACTACCCACGTT‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种RT-LAMP核酸试纸条试剂盒，其特征在于，包括如下引物组和核酸检测试纸条:所述引物组的核苷酸序列如下所示：外引物、F3：5’-CGTGGATGGTCAAAGTCGT-3’；B3：5’-ACCTACACTCCAGGAAGGAC-3’；内引物、FIP：5-Biotin-TAGTTCTGGCATGGCCTCGC-CTTTACATGTGCTGCAGGGA-3’；BIP：5-Fitc-TGTTCGGACGTTCTCTTCCGGA-TTTAATGGCGCGGACGAC-3’；环引物、LoopF：5’-AGCCTAGATTCGCACTCCG-3’；LoopB：5’-CGAGGAGACTACCCACGTT-3’。2.根据权利要求1所述的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒，其特征在于，用生物素和荧光素对上述引物组中的引物进行标记。3.根据权利要求1所述的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒，其特征在于，还包括：硫酸镁、甜菜碱、dNTPs、AMV反转录酶、Bst聚合酶、缓冲液。4.根据权利要求1所述的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒，其特征在于，RT-LAMP反应的初始反应体系包括：浓度为100mmol/L的硫酸镁、浓度为5mmol/L的甜菜碱、浓度为2.5mmol/L的dNTPs、浓度为10U/μL的AMV反转录酶、浓度为8U/μL的Bst聚合酶、RNase-freewater的加入量为3.7μL、缓冲液的加入量为2.5μL、外引物的浓度为10μmol/L、环引物的浓度为10μmol/L、内引物的浓度为10μmol/L。5.一种如权利要求1～4任一所述的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒的应用，其特征在于，包含以下步骤：(1)配置RT-LAMP反应体系：按终浓度计算，浓度为0～6mmol/L的硫酸镁、浓度为0～1.5mmol/L的甜菜碱、浓度为0.2～0.7mmol/L的dNTPs、...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈绮汶，梁国智，梅敏敏，黄雯晶，李晓文，刘明文，蔡跃佳，李秋艺，李文俊，陈灿君，傅禹铭，黄兴国，黄淑坚，
申请(专利权)人：佛山科学技术学院，
类型：发明
国别省市：广东,44