一种水稻隐性核雄性不育基因cyp704b2的分子标记及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种水稻隐性核雄性不育基因cyp704b2的分子标记和应用，属于植物生物技术领域。本发明专利技术的分子标记包含两条正向引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、一条反向引物SEQ ID NO.3。利用该分子标记，只需通过常规的PCR和PAGE胶电泳即可完成对水稻隐性核雄性不育基因cyp704b2的基因分型。本发明专利技术具有操作简便、分型快速、结果准确、成本低廉等优势，能提高目标性状选择效率，满足大规模分子标记辅助选择育种的需求。

Molecular marker of rice Recessive Genic Male Sterility Gene cyp704b2 and application thereof

The invention provides a molecular marker and application of a Recessive Genic Male Sterility Gene cyp704b2 of rice, belonging to the field of plant biotechnology. The molecular marker of the invention contains two forward primers SEQ and SEQ ID NO.1 ID NO.2, a SEQ ID NO.3 reverse primer. Using this molecular marker, the genotype of the Recessive Genic Male Sterile Gene cyp704b2 of rice can be accomplished only by conventional PCR and PAGE gel electrophoresis. The invention has the advantages of simple operation, rapid classification, accurate result, low cost, etc., and can improve the efficiency of target character selection and meet the requirement of large-scale molecular marker assisted selection breeding.

【技术实现步骤摘要】
一种水稻隐性核雄性不育基因cyp704b2的分子标记及其应用
本专利技术属于植物生物
，具体地说，涉及一种水稻隐性核雄性不育基因cyp704b2的分子标记及其应用。
技术介绍
雄性不育系的发掘和利用是提高作物产量和获取杂种优势的重要途径。目前，主要的杂交育种方法有“三系法”和“两系法”，二者在提高作物产量和保证国家粮食安全中发挥了非常重要的作用，但也都存在一些比较明显的弊端。比如，三系法的利用中不仅需要选育质核互作的雄性不育系，受恢保关系的制约，同时还需要选育对应的保持系和恢复系才能进行繁种和制种，育种过程复杂、育种周期冗长、育种效率和种质资源利用率低下；以光温敏不育系为基础的两系法虽然打破了恢保关系的限制，但光温敏雄性不育材料的育性受到环境温度和光照变化的影响，易导致繁种和制种失败，造成两系杂交法难以大量推广应用。单隐性核雄性不育基因控制的不育系恰好克服了“三系法”和“两系法”的缺陷，其育性不受光温条件影响，兼具三系法的稳定性和两系法配组灵活性的优点，因而具有重要的潜在商业利用价值。水稻材料1907是海南波莲水稻基因科技有限公司于2013年6月在湖南省农业科学院用钴60辐射籼稻材料9311后，经多世代筛选而获得的一个由单基因(cyp704b2)控制的无花粉型隐性核雄性不育、雌性可育的突变体材料。在该突变体中野生型CYP704B2基因编码区第794个碱基后的GGG被替换为T，造成了移码突变和翻译提前终止，导致野生型CYP704B2蛋白C端339个氨基酸被Tyr-Ala-Val-Thr所取代，最终产生不育表型(龙湍，安保光，李新鹏，等.籼稻9311辐射诱变突变体库的创建及其筛选.中国水稻科学，2016，30(1)：44-52)。DNA分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组遗传差异的特异DNA片段。对于基因组中核苷酸序列已知的小片段插入缺失类型的遗传差异一般可使用特异引物PCR标记进行检测，例如STS(sequnce-taggedsite)标记，引物扩增受阻突变体系PCR标记，CAPS(CleavedAmplifiedPolymorphismSequences)标记，dCAPS(DerivedCleavedAmplifiedPolymorphicSequences)标记等(管峰，艾君涛，杨利国.一种SNP检测新方法:四引物扩增受阻突变体系PCR技术.生命的化学，2004，24(6)：514-516；王忠华，RedusMARC，贾育林.水稻抗稻瘟病基因Pi-ta共显性分子标记的建立.中国水稻科学，2005，19(6)：483-488；水稻紫色果皮的延迟遗传及Pb基因功能标记开发.中国水稻科学，2014，28(6)：605-611；张亚东，周丽慧，郑佳，等。2016，一种鉴定水稻粒长基因qGL3等位基因变异的PCR分子标记方法，专利号：CN103882145B；丁丹，张亚东，郑佳.水稻粒长基因GS3和qGL3功能标记的设计及应用.江苏农业学报，2014，30(6)：1191-1197)。然而这些方法在实用性、检测效率或使用成本上各自存在不同程度的局限性，因而不利于大规模、批量化的育种实践运用。鉴于隐性核雄性不育材料在育种中潜在的巨大商业价值及运用前景，针对基因中引起功能变异的碱基序列，设计与隐性核雄性不育、雌性可育表型完全一致且操作简便、分型快速、使用灵活、费用低廉的分子标记，将成为广大育种者不可或缺的辅助育种工具。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种水稻隐性核雄性不育基因cyp704b2的分子标记。本专利技术的第二个目的是提供利用上述分子标记鉴定水稻隐性核雄性不育基因cyp704b2基因型的方法及其应用。本专利技术的第三个目的是提供利用上述分子标记同时鉴定水稻的基因型和水稻是否存在隐性核雄性不育基因cyp704b2的方法及其应用。本专利技术提供的一种水稻隐性核雄性不育基因cyp704b2的分子标记，其通过核苷酸序列如SEQIDNO.1-3所示的引物扩增得到。本专利技术提供了上述分子标记在鉴定水稻隐性核雄性不育基因cyp704b2基因型中的应用。本专利技术提供了上述分子标记在水稻育种中的应用。本专利技术提供了用于检测水稻隐性核雄性不育基因cyp704b2的特异性引物组合，含有核苷酸序列如SEQIDNO.1-3所示的引物。其中，SEQIDNO.1所示的正向引物M1907-F1：TGTCGGGTTTGGGGTTGAGATAGGG，SEQIDNO.2所示的正向引物M1907-F2:GGGTTTGGGGTTGAGATCTAAGCT，和SEQIDNO.3所示的反向引物M1907-R:AGCGTGACGATGATGTTGGCAGC。本专利技术上述引物组合是针对野生型CYP704B2基因的编码区第794位碱基后GGG被替换为T的突变设计、筛选后获得。M1907-F1和M1907-F2的3’末端碱基分别为GGG和GCT，只能分别与野生型和突变型完全配对。此外，M1907-F1的5’端增加了不完全配对序列TGTC用以引入扩增片段长度多态性，M1907-F1和M1907-F2的3’端第四个碱基均引入C→A的突变用以扩大M1907-F1和M1907-F2对目标序列识别能力的差异。M1907-R为公共反向引物，可以分别与M1907-F1和M1907-F2配对扩增出96bp和90bp的PCR产物。本专利技术提供了前述特异性引物组合在鉴定水稻隐性核雄性不育基因cyp704b2基因型中的应用。本专利技术提供了前述特异性引物组合在鉴定特定水稻种质资源中是否存在隐性核雄性不育基因cyp704b2的方法。本专利技术提供了前述特异性引物组合在水稻种质资源改良中的应用。进一步地，本专利技术提供了检测水稻隐性核雄性不育基因cyp704b2基因型及其是否存在于某一特定水稻种质资源中的方法，首先对待测样本提取基因组DNA后，利用SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的正向引物、SEQIDNO.3所示的反向引物进行PCR，对PCR扩增产物大小进行分析。若扩增产物只出现90bp条带，则表明待测样品具有纯合突变基因型cyp704b2；若只出现96bp条带，则表明待测样品为纯合野生基因型CYP704B2；若同时出现90bp和96bp条带，则表明待测样品为杂合基因型。90bp条带的参考序列如SEQIDNO.4所示，96bp条带的参考序列如SEQIDNO.5所示。本领域技术人员应当理解，由于水稻品种的差异，设计引物时预测的PCR产物序列只能作为参考序列，而从不同品种中扩增出来的产物的序列可能和参考序列完全一致，也可能与参考序列有部分碱基差异，但这种差异通常不会影响标记的使用。进一步地，PCR的反应体系为：Biomiga的2×BenchTopTMTaqmastermix4μL，10μM的两个正向、一个反向引物各0.5μL，10％DMSO0.5μL，模板DNA50ng，补ddH2O至10μL；PCR反应条件为：94℃，4min；94℃、20s，63℃、20s，72℃、20s，共35个循环，接着72℃、5min，最后16℃，1min。在本专利技术的实施例中，是通过PAGE胶电泳对PCR扩增产物长度进行判断，PAGE胶电泳条件为：6％PAGE胶，U＝2000V，I＝20本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水稻隐性核雄性不育基因cyp704b2的分子标记，其特征在于，通过核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑3所示的引物扩增得到。

【技术特征摘要】
1.一种水稻隐性核雄性不育基因cyp704b2的分子标记，其特征在于，通过核苷酸序列如SEQIDNO.1-3所示的引物扩增得到。2.权利要求1所述的分子标记在鉴定水稻隐性核雄性不育基因cyp704b2基因型中的应用。3.权利要求1所述的分子标记在水稻育种中的应用。4.用于检测水稻隐性核雄性不育基因cyp704b2的特异性引物组合，其特征在于，含有核苷酸序列如SEQIDNO.1-3所示的引物。5.权利要求4所述的特异性引物组合在鉴定水稻隐性核雄性不育基因cyp704b2基因型中的应用。6.权利要求4所述的特异性引物组合在水稻种质资源改良中的应用。7.检测水稻隐性核雄性不育基因cyp704b2基因型的方法，其特征在于，对待测样本提取基因组DNA后，利用SEQIDNO.1-3所示的引物组合进行PCR，对PCR扩增产物进行PAGE胶电泳...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄培劲，龙湍，李佳林，唐杰，李新鹏，张维，安保光，曾翔，吴永忠，
申请(专利权)人：海南波莲水稻基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：海南,46