一种基于ATP4B基因体DNA的表观修饰检测引物对及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开一种基于ATP4B基因体DNA的表观修饰检测引物对及试剂盒。本发明专利技术首先提供了核苷酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的ATP4B基因体DNA片段在作为胃癌早期诊断、化疗敏感性检测的分子标志物或药物作用靶点及制备相关检测试剂盒中的应用。进一步提供了一种用于胃癌早期诊断、化疗敏感性检测的分子标志物和试剂盒。所述试剂盒包括如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示甲基化引物和如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示非甲基化引物。通过本发明专利技术得到的检测结果可以为胃癌患者病情及个体化用药监测，肿瘤早期预警，也为药物治疗的愈后提供了评价方法。

A kind of modified detection primer and kit of ATP4B genome meter based on DNA

The invention discloses a modified concept detection primer and kit of ATP4B genome meter based on DNA. The present invention provides the first nucleotide sequence of SEQ ID or SEQ No.1 ID shown in the No.2 ATP4B genome segment DNA in the early diagnosis of gastric cancer as molecular marker, chemotherapy sensitivity or drug targets and preparation kit in application. Further, a molecular marker and kit for early diagnosis of gastric cancer and detection of chemosensitivity are provided. The kit includes such as SEQ ID and SEQ No.3 ID No.4 shown methylation primers such as SEQ ID and No.5 and SEQ ID No.6 shown non methylated primers. The detection result obtained by the invention can provide an evaluation method for the patient's condition and individual medication monitoring, the early warning of the tumor and the recovery of the medicine treatment.

【技术实现步骤摘要】
一种基于ATP4B基因体DNA的表观修饰检测引物对及试剂盒
本专利技术涉及一种用于基因体DNA甲基化修饰检测。更具体地，涉及基于PCR检测ATP4B基因体DNA甲基化修饰引物对及试剂盒。
技术介绍
胃癌是世界上最主要的恶性肿瘤之一，到目前为止仍然是世界上第三大致死性癌症，在亚洲的发病率越来越高(BrayF，etal.LancetOncol13:790-801,2012；Ushijima,T.,JBiochemMolBiol,2007.40(2):p.142-50.)，由于缺乏早期发现的有效检测手段，在就诊患者中，90％以上处于中晚期。而对于中晚期的患者，临床治疗多以化疗为主，这样的治疗方式虽然能在一定程度上抑制肿瘤的发展，但化疗所产生的副作用以及后期病人对化疗药的耐受，是不可忽视并亟需解决的问题，因此鉴别胃癌早期诊断和监测化疗敏感性的分子标志物及治疗靶点具有重要的临床应用价值(Bloushtain-Qimron,N.,etal.,ProcNatlAcadSciUSA,2008.105(37):p.14076-81；Schneider,B.G.andR.M.Peek,Jr.,CancerPrevRes(Phila),2013.6(4):p.253-6.)。胃H+，K+-ATP酶(ATP4)是异源二聚体(<αβ>2)，由两个催化α-亚基和两个调节β-亚基组成，编码基因分别为ATP4A和ATP4B。ATP4在胃-肠壁细胞中表达，ATP4A除了在胃中高表达，在人体组织中也呈现出广泛表达模式，因此被认为其发挥着管家基因的作用；而ATP4B在细胞和组织中的表达呈特异性，因为被认为是胃功能基因。ATP4作为胃中质子泵泵出H(+)交换管腔中的K(+)，也是胃酸性分泌的最后一步。ATP4B是胃H，K-ATP酶重要的组成部分，对保持胃组织结构与功能的平衡不可缺少(Scarff,K.L.,etal.,Gastroenterology,1999.117(3):p.605-18.)，如ATP4B曾被报道在小鼠模型中对其胃壁细胞生长和发挥功能起着重要作用。用于ATP4过度活化可能导致酸消化性溃疡疾病和胃黏膜炎症，因此ATP4是酸相关性胃疾病(胃及十二指肠溃疡和胃食管反流病)治疗中药物(如抑酸药如质子泵抑制剂，PPI)的主要药物靶标(Sachs,G.,etal.,JClinGastroenterol,2007.41Suppl2:p.S226-42.)。抑酸药如质子泵抑制剂在全球应用非常广泛，相关药物市场达数百亿美元，在美国属于非处方药，因而存在滥用的风险。最近研究发现，使用抑酸药抑制质子泵包括ATP4与胃癌发生的风险有相关性。如一项Meta分析的11项研究，汇集94558名参与者(5980例胃癌患者和88578名对照组)表明抑酸药物的使用与胃癌风险增加有显著关联。有报道提示ATP4在人胃癌组织中的低表达，与胃非贲门腺癌患者的不良预后相关(Herrmann,M.,etal.,ScandJGastroenterol,2007.42(11):p.1275-88；Ordonez,G.R.,etal.,GenomeBiol,2008.9(5):p.R81.)。最近的研究表明，ATP4B在胃癌中的表达下调(Hasegawa,S.,etal.,CancerRes,2002.62(23):p.7012-7；Kim,B.,etal.,CancerRes,2003.63(23):p.8248-55；Wang,G.,etal.,PLoSOne,2013.8(5):p.e63826.)。但ATP4B也曾被报道在人肝细胞癌中高表达(Shao,R.X.,etal.,WorldJGastroenterol,2005.11(13):p.1995-9.)。这些研究虽印证ATP4B在胃癌发生发展过程中的重要性，但到目前为止仍然没有确定ATP4B在胃癌发生发展过程中的异常表达及机制其调控方式，及ATP4B功能的中断是否与胃癌的发展有关(Scarff,K.L.,etal.,Gastroenterology,1999.117(3):p.605-18.)。因此，ATP4B是澄清胃癌发生是否与采用质子泵抑制剂等阻断胃酸从而抑制H，K-ATP酶重要线索(Toh,B.H.,J.W.Sentry,andF.Alderuccio,ImmunolToday,2000.21(7):p.348-54.)。ATP4B有可能成为胃酸抑制剂治疗是否导致胃癌发生的重要靶点，但如何检测ATP4B在胃细胞/组织中的特异性早期表达变化是一挑战。表观遗传调控模式，如DNA甲基化和组蛋白修饰等，在正常发育和组织特异性基因表达中起着重要的作用(Deaton,A.M.,etal.,GenomeRes,2011.21(7):p.1074-86.)。表观遗传调控是一个可逆的和渐进的过程，它的改变极大程度上参与了如胃癌等慢性炎症相关的癌症的发生(Lorincz,M.C.,etal.,NatStructMolBiol,2004.11(11):p.1068-75；Ordonez,G.R.,etal.,GenomeBiol,2008.9(5):p.R81)。事实上，肿瘤抑制基因在基因启动子区域由于甲基化引起的沉默是癌细胞最明确的表观遗传标志，因而对于胃癌的早期检测，治疗和预后评价具有重要意义。因此，鉴于表观遗传学改变对于癌症发生的重要性，界定在肿瘤发生过程中的组织特异性的表观遗传改变以进行精准医疗研究是亟不可待的(Jjingo,D.,etal.,Oncotarget,2012.3(4):p.462-74.)。细胞/组织中基因的特异性表达可受基因体(intragenic)DNA甲基化和组蛋白修饰等表观遗传模式调控的(Shao,R.X.,etal.,WorldJGastroenterol,2005.11(13):p.1995-9.)。细胞/组织特异性的DNA甲基化多发于基因体内的CpG岛。基因体内近TSS位点的DNA甲基化被认为是基因转录沉默以及组织特异性表达的重要原因(Jjingo,D.,etal.,Oncotarget,2012.3(4):p.462-74.)。这种调控紊乱与癌症的发生发展密切相关。专利技术人在近期的研究中首先发现ATP4B在胃癌细胞系和胃癌组织中mRNA分别呈现出低表达的状态；而胃正常人永生化细胞系GES-1以及癌旁组织中mRNA和蛋白呈现表达状态(如图1所示)，提示ATP4B的表达在人胃癌肿瘤组织和细胞株显著降低经过进一步筛选鉴定，肿瘤组织细胞中ATP4B基因体呈现高甲基化状态具显著性(如图2所示)。另外，使用表观药曲表观药物DNA甲基化抑制剂5-aza-21-脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine，5-Aza)和组蛋白去乙酰化抑制剂曲古抑菌素A(trichostatin，TSA)以及二者联合用药可逆转ATP4B在胃癌细胞和胃癌组织中表达沉默，而且表观药物5-Aza和TSA可引起的组蛋白乙酰化可显著且特异地富集在ATP4B基因体区域，提示ATP4B在胃癌细胞和胃癌组织中表达沉默受表观调控(如图3所示)，表明ATP4B在胃癌中表达沉默与其基因体(intragenic)本文档来自技高网...

【技术保护点】
ATP4B基因体DNA片段在制备胃癌早期诊断、化疗敏感性检测的分子标志物或药物作用靶点中的应用。

【技术特征摘要】
1.ATP4B基因体DNA片段在制备胃癌早期诊断、化疗敏感性检测的分子标志物或药物作用靶点中的应用。2.ATP4B基因体DNA片段在制备胃癌早期诊断、化疗敏感性检测的试剂盒中的应用。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述ATP4B基因体DNA片段的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；优选的，所述ATP4B基因体DNA片段的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。4.一种用于胃癌早期诊断、化疗敏感性检测的分子标志物，其特征在于：所述分子标志物为权利要求1-3任一所述ATP4B基因体DNA片段上发生的表观修饰；其中，所述表观修饰可以为DNA甲基化修饰或DNA相关组蛋白修饰。5.一种用于胃癌早期诊断、化疗敏感性检测的试剂盒，其特征在于：包括ATP4B基因体DNA片段的甲基化引物和非甲基化引物，其中，所述甲基化引物的上游引物核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，下游引物核苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄家强，林舒晔，林博楠，王晓月，
申请(专利权)人：北京交通大学，
类型：发明
国别省市：北京,11