KIT基因突变检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种KIT基因突变检测试剂盒，包括：（1）用于扩增样本中KIT基因Exon9、11、13、14和17五个外显子的特异性引物，引物序列分别是SEQ ID Nos：1‑10；（2）用于测序PCR的测序引物，用于对KIT基因Exon9、11、13、14和17五个外显子进行测序分析，引物序列是SEQ ID Nos：11‑15；（3）5个装有KIT野生型质粒和突变型质粒按1:1质量比例混合的阳性质控品管和1个装有PCR反应预混液的试管。本试剂盒中不同外显子的PCR扩增条件一致，能在样本浓度较低时检测到目的基因，结果无非特异性扩增。

KIT mutation detection kit

The invention provides a KIT gene mutation detection kit, including: (1) specific primers for amplification of KIT gene in Exon9 samples, 11, 13, 14 and 17 of five exons, primer sequences were SEQ ID Nos:1 (10; 2) for sequencing primer sequence PCR. For KIT Exon9, 11, 13 genes and 14 17 and five exons were sequenced, primers are SEQ ID Nos:11 15; 5 (3) positive control tube with KIT wild type plasmid and mutant plasmid mixed by 1:1 mass ratio and 1 mixed liquid with PCR pre reaction tube. The PCR amplification conditions of different exons in this kit are consistent, and the target gene can be detected when the sample concentration is low, but the result is no specific amplification.

【技术实现步骤摘要】
KIT基因突变检测试剂盒
本专利技术涉及一种试剂盒，具体涉及一种肿瘤相关基因KIT基因突变检测试剂盒。
技术介绍
胃肠道间质瘤（GIST）是消化道最常见的间叶源性肿瘤。绝大部分的GIST均表达c-kit基因编码的Kit蛋白（CD117），c-kit基因位于人染色体4q12-13，属于原癌基因，其产物是Ⅲ型酪氨酸激酶。在分子层面上，大部分的GIST均存在c-kit基因突变，从而导致kit蛋白的活化不需要配体SCF参与就能刺激肿瘤细胞的持续增殖和抗凋亡信号的失控。格列卫（Glivec）是一种酪氨酸激酶抑制剂，经FDA批准可用于治疗c-kit阳性、不能手术切除和/或转移性的恶性GIST，其临床疗效令人振奋。其作用机理在于药物结合于Kit蛋白胞浆内酪氨酸激酶功能区的ATP结合位点，阻断磷酸基团由ATP向底物酪氨酸残基的转移，从而抑制细胞增殖并恢复细胞凋亡程序。GIST中c-kit基因突变率约为90%，且突变形式多样。其中位于11号外显子Lys550-Val560区段的变异最为常见（约占70-80%），位于9号外显子Ala502-Tyr503区段的6碱基重复突变约占5-10%。临床研究表明GIST中c-kit基因的突变情况与格列卫分子靶向治疗的疗效相关：存在11号外显子突变患者的疗效最好，存在9号外显子突变的患者疗效次之，而野生型GIST的疗效最差。另外，对于9号外显子突变的患者，提高用药剂量可显著提高疗效。检测c-kit基因突变对于指导GIST患者的合理用药，具有重要的参考价值。另外，c-kit的配体为干细胞生长因子。c-kit受体正常表达于造血干/祖细胞，在急性淋巴细胞白血病中极少或不表达，而在急性髓性白血病(AML)中则表达较高，但在AML的各亚型表达不尽一致，因而c-kit受体检测有助于急性白血病(AL)的分类诊断和分型诊断。c-kit在原发性AML患者的表达高于MDS转变的AML，因此，c-kit检测有助于两种不同AML的鉴别诊断。SCF/c-kit诱导的细胞凋亡耐受与AML患者化疗疗效差有关，抗c-kit单抗可逆转AL细胞对化疗的凋亡耐受，这为难治性AML的治疗提供了新的思路。KIT基因突变的检测主要有Sanger测序法、ARMS、RT-PCR等。其中RT-PCR技术采用等位基因特异性扩增法对样本的基因突变进行区分，该方法成本较低，但检测率较高，容易出现假阴性结果；ARMS技术是目前国内应用最为广泛的技术，但只能检测已知的位点，且要将样本分成多个管进行实验才能实现分型，对样本量要求高；而Sanger测序法是DNA序列分析的经典方法，最直接的、可检测已知和未知突变的一种方法。由于该方法可直接读取DNA的序列，因此被认为是基因分型的金标准，其主要优点是测序长度较长，可发现新的变异位点，包括一些新的少见的突变形式及突变的确切类型，如点突变、片段缺失。所以探索一种可以采用Sanger测序法检测KIT基因的技术具有重要的临床意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决上述问题，提供一种KIT基因突变检测试剂盒，可直接利用含人体某组织部位的石蜡包埋样本通过Sanger测序法检测出样本中KIT基因主要突变位点型别，检测位点包括KIT基因9、11、13、14和17五个外显子的主要突变位点，包括但不限于9号外显子上c.15091510insGCCTAT突变位点；11号外显子上c.16481680del缺失突变位点；13号外显子上c.1961T>C突变位点；14号外显子上c.2009C>T突变位点，17号外显子上c.2247A>T突变位点。本专利技术的KIT基因突变检测试剂盒具体包括：（1）用于扩增样本中KIT基因Exon9、11、13、14和17五个外显子的特异性引物，具体序列如下:（2）用于测序PCR的测序引物，分别用于对KIT基因Exon9、11、13、14和17五个外显子进行测序分析，具体序列如下：外显子名称序列号Reverse5’-3’9SEQ-K9SEQIDNo.11AGCCAGGGCTTTTGTTTTCT11SEQ-K11SEQIDNo.12AAACAAAGGAAGCCACTGGA13SEQ-K13SEQIDNo.13GTTCCTGTATGGTACTGCATGCG14SEQ-K14SEQIDNo.14TCTCACCTTCTTTCTAACCTTTTCTT17SEQ-K17SEQIDNo.15TTTGACTGCTAAAATGTGTGA3）5个装有KIT野生型质粒和突变型质粒按1:1质量比例混合的阳性质控品管和1个装有PCR反应预混液的试管；其中突变型质粒包括9号外显子上c.15091510insGCCTAT突变位点；11号外显子上c.16481680del缺失突变位点；13号外显子上c.1961T>C突变位点；14号外显子上上c.2009C>T突变位点；17号外显子上c.2247A>T突变位点；PCR反应预混液由以下组份组成：组份体积（μl）10PCRbuffer2.55Qsolution525mMMgCl22.525mMdNTPs0.4H2O9.35其中10×PCRbuffer中含有500mMKCl，100mMTris-HCl(pH8.3)，100mM(NH4)2SO4，和15mMMgCl2；5×Qsolution中含有1MTricine[pH8.7(withKOH)]，8%(v/v)Glycerol和5%(v/v)DMSO；25mMdNTPs中含有25mMdATPs、25mMdTTPs、25mMdCTPs和25mMdGTPs。本试剂盒主是根据KIT基因的Exon9、11、13、14和17五个外显子的保守序列分别设计KIT基因四个外显子的特异性引物，分别将Exon9、11、13、14和17号外显子使用PCR的方法进行扩增，纯化回收扩增产物。本专利技术的各种引物长度在20-25个碱基之间，无特殊修饰。反应液预混液采用独特的配方及比例。不同外显子的PCR扩增条件一致，且能在样本浓度较低时检测到目的基因，结果无非特异性扩增。具体操作流程包括：（1）引物设计：利用引物设计软件，如PrimerPremier5，从KIT基因DNA序列中挑选特定的序列，然后根据碱基互补特点，设计KIT基因Exon9、11、13、14和17五个外显子的特异性引物，用于扩增样本中DNA。测序引物的设计与用于扩增样本中DNA的特异性引物的设计类似，不过测序引物只需要一段即可，引物序列分别是SEQIDNOs：1-15。长度在20-25个碱基左右（2）PCR扩增：利用试剂盒中含特定序列的引物PCR扩增临床样本中的DNA。（3）琼脂糖凝胶电泳及胶回收：将扩增得到的目的基因KIT的Exon9、11、13、14和17五个外显子片段回收用于测序。附图说明以下是附图的说明，以便于理解上述专利技术的目的和具体特征。图1为KIT基因的Exon9、11、13、14和17五个外显子的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果。图1中各标号的具体表示如下：1：1号样本；2：2号样本；3：3号样本；9：KIT基因第9号外显子；11：KIT基因第11号外显子；13：KIT基因第13号外显子；14：KIT基因第14号外显子；17：KIT基因第17号外显子本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于KIT基因突变检测的Exon9、11、13、14和17五个外显子的引物，引物序列分别是SEQ ID Nos：1‑15。

【技术特征摘要】
1.用于KIT基因突变检测的Exon9、11、13、14和17五个外显子的引物，引物序列分别是SEQIDNos：1-15。2.KIT基因突变检测试剂盒，包括：（1）用于扩增样本中KIT基因Exon9、11、13、14和17五个外显子的特异性引物，引物序列分别是SEQIDNos：1-10；（2）用于测序PCR的测序引物，用于对KIT基因Exon9、11、13、14和17五个外显子进行测序分析，引物序列是SEQIDNos：11-15；（3）5个装有KIT野生型质粒和突变型质粒按1:1质量比例混合的阳性质控品管和1个装有PCR反应预混液的试管；其中突变型质粒包括9号外显子上c.15091510insGCCTAT突变位点；11号外显子上c.16481680del缺失突变位点；13号外显子上c.1961...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈俊飞，郑焱，陈佩璇，徐锋，谢龙旭，
申请(专利权)人：广州凯普医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44