检测毕赤酵母细胞DNA的引物及方法技术

本发明专利技术提供了检测毕赤酵母细胞基因组DNA的引物对、包含该引物对的试剂盒以及利用该引物对检测毕赤酵母细胞基因组DNA的方法，所述引物对特异性结合于SEQ ID NO:1所示序列。利用所述引物对的PCR检测方法操作不仅简便快捷、灵敏度高，还能区分真核宿主细胞，例如Vero细胞、CHO细胞，特别是人细胞的干扰性DNA。

Primer and method for detecting Pichia pastoris cell DNA

The present invention provides detection of Pichia pastoris genomic DNA primer kit, the primers and the primer method for detection of Pichia pastoris cell genome contains DNA, the primers for specific binding to SEQ ID NO:1 shown in sequence. The PCR detection method using the primer pair is not only simple, fast and sensitive, but also can distinguish the eukaryotic host cells, such as Vero cells, CHO cells, especially human cells, and interfere with DNA.

【技术实现步骤摘要】
检测毕赤酵母细胞DNA的引物及方法
本专利技术涉及生物检测领域。具体地说，本专利技术涉及毕赤酵母(PichiaPastoris)细胞DNA的检测引物及方法。
技术介绍
在现代，生物重组制品已广泛应用于医药健康领域，发挥着越来越重要的作用。这些生物制品包括重组蛋白药物、基因重组疫苗、生物抗原抗体以及各种细胞因子等。重组生物制品的应用与人类健康事业息息相关，国际上对其的质量控制和安全性检测都具有极其严格的要求。重组生物蛋白绝大多数由大规模的基因改造工程宿主细胞生产，细胞中复杂的非目标产物是终产物中主要的杂质来源，直接影响生物制品的安全性。其中残余的生物遗传物质DNA是一个非常重要的污染，因此，对它的检测是重要的质量控制环节。在重组生物蛋白制品中，残余DNA多来源于培养的宿主细胞。这些宿主细胞多为原核细胞、外源哺乳动物细胞以及肿瘤来源细胞。理论上，存在于生物制品中的微量DNA杂质，都有可能传递与肿瘤或病毒相关的基因，并导致癌变或其它病理变化。当一定量的残留DNA与制品一同进入人体后，含有致癌基因的DNA片段就可能诱发肿瘤的产生；如果生物制品中含有某些可以整合病毒的DNA，则这种DNA通过表达后具备感染性，从而导致一系列的不良后果。在生产重组生物蛋白的宿主细胞中，毕赤酵母(PichiaPastoris)是重要的一类，其甲醇营养型酵母，能够利用甲醇作为唯一碳源和能源。巴斯德毕赤酵母的生物学特点之一是，甲醇代谢所需的醇氧化酶被分选到过氧化物酶体中，形成区域化。以葡萄糖作碳源时，菌体中只有1个或很少几个小的过氧化物酶体，而以甲醇作碳源时，过氧化物酶体几乎占到整个细胞体积的80％，AOX增至细胞总蛋白的35％-40％。因此，当在AOX基因前利用同源重组方式插入外源蛋白基因时，可获得大量表达。同时，根据甲醇酵母这种可以形成过氧化物酶体的特性，既可利用该系统表达一些毒性蛋白和易被降解的酶类，也可用以研究细胞特异区域化的生物发生及其机制和功能，为高等动物类似的研究提供启示。利用毕赤酵母表达外源性蛋白的优点在于：(1)具有醇氧化酶AOX1基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一；(2)表达效率高，其表达的外源蛋白可占总表达蛋白的90％以上，有利于目的蛋白的分离纯化；(3)在简单合成培养基中可实现高密度培养；(4)表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合；(5)由于该酵母可以以甲醇为唯一碳源和能源，而绝大多数微生物并不能以甲醇为碳源，可以减少污染。根据相关监管机构对来自毕赤酵母的生物制品，其宿主DNA的限量为10ng/剂。关于生物制品中宿主细胞残余DNA的限量检测，过去比较普遍的采用分子杂交的半定量方法。该方法基于传统的分子基因杂交技术，需要的检测条件相对简单，检测限在10pg左右基本能够满足一些疫苗和治疗性生物制品的检测需求。但由于该方法存在时间长、操作繁琐、稳定性、敏感性、特异性较差等缺点，已经不能满足日益严苛的检测要求，在一些发达国家已经淘汰。Taqman探针检测属于实时定量PCR技术，是一种快速的高通量检测方法，它在PCR扩增过程中加入一个特异性的荧光探针，通过荧光信号的变化反映产物的增加情况，从而能够定量分析样本中的初始模板。近年来，由于Taqman探针技术在特异性、灵敏性、准确性方面的独特优势，其在检测基因突变、基因定量等疾病相关检测领域得到广泛的承认及应用。然而，该方法仍然存在样本需要预处理、各实验室引物探针设计不同、没有统一标准物质等等问题，对以上问题仍需要进一步研究、解决。综上所述，本领域急需检测生物制品中毕赤酵母DNA的方法，该方法应具备灵敏性、操作简便、标准统一等优点并且能区分毕赤酵母DNA与其它真核宿主细胞DNA，从而能用于生物制品质量控制。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高灵敏度，并能区分毕赤酵母DNA与其它真核宿主细胞DNA的检测毕赤酵母细胞基因组DNA的引物对，以及包含所述引物对的检测试剂或PCR试剂盒。本专利技术的另一目的是提供一种利用本专利技术提供的引物对或检测试剂检测毕赤酵母细胞基因组DNA的方法或PCR方法。在第一方面，本专利技术提供一种检测毕赤酵母细胞基因组DNA的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于毕赤酵母细胞基因组DNA上SEQIDNO:1所示序列的第84-103位；其中的反向引物结合于SEQIDNO:1所示序列的第151-170位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为80-90bp。在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为18-22bp；优选20bp。在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm温度为59-61℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤2℃。在具体的实施方式中，所述引物对中，所述正向引物如SEQIDNO:2所示，所述反向引物如SEQIDNO:3所示，或者，所述正向引物如SEQIDNO:6所示，所述反向引物如SEQIDNO:7所示，或者，所述正向引物如SEQIDNO:10所示，所述反向引物如SEQIDNO:11所示，或者，所述正向引物如SEQIDNO:12所示，所述反向引物如SEQIDNO:13所示；优选地，所述正向引物如SEQIDNO:2所示，所述反向引物如SEQIDNO:3所示。在第二方面，本专利技术提供一种检测试剂，所述检测试剂包含本专利技术第一方面所述的引物对。在具体的实施方式中，所述引物对中，所述正向引物如SEQIDNO:2所示，所述反向引物如SEQIDNO:3所示，或者，所述正向引物如SEQIDNO:6所示，所述反向引物如SEQIDNO:7所示，或者，所述正向引物如SEQIDNO:10所示，所述反向引物如SEQIDNO:11所示，或者，所述正向引物如SEQIDNO:12所示，所述反向引物如SEQIDNO:13所示；优选地，所述正向引物如SEQIDNO:2所示，所述反向引物如SEQIDNO:3所示。在具体的实施方式中，所述检测试剂还包含探针。在优选的实施方式中，所述探针如SEQIDNO:8或SEQIDNO:4所示。在优选的实施方式中，所述检测试剂的检测灵敏度为1fg/μl。在具体的实施方式中，所述检测试剂包含的引物对中，所述正向引物如SEQIDNO:2所示，所述反向引物如SEQIDNO:3所示；而所述检测试剂包含的探针如SEQIDNO:4所示。在第三方面，本专利技术提供一种检测毕赤酵母细胞基因组DNA的方法，所述方法包括：利用本专利技术第一方面所述的引物对或本专利技术第二方面所述的检测试剂，对待测样品进行PCR，并检测PCR扩增产物。在第四方面，本专利技术提供一种PCR试剂盒，所述试剂盒中包括容器以及位于所述容器中的本专利技术第一方面所述的引物对。在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为18-22bp；优选20bp。在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm温度为59-61℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤2℃。在优选的实施方式中，所述引物对中，所述正向引物如SEQIDNO:2所示，所述反向引物如SEQIDNO:3所示，或者，所述正向引物如SEQIDNO:6所示，所述反向引物如SEQIDNO:7所示，或者，所述正向引物如SEQIDNO:10所示，所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测毕赤酵母细胞基因组DNA的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于毕赤酵母细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第84‑103位；其中的反向引物结合于SEQ ID NO:1所示序列的第151‑170位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为80‑90bp。

【技术特征摘要】
1.一种检测毕赤酵母细胞基因组DNA的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于毕赤酵母细胞基因组DNA上SEQIDNO:1所示序列的第84-103位；其中的反向引物结合于SEQIDNO:1所示序列的第151-170位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为80-90bp。2.如权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述引物对中，所述正向引物如SEQIDNO:2所示，所述反向引物如SEQIDNO:3所示，或者，所述正向引物如SEQIDNO:6所示，所述反向引物如SEQIDNO:7所示，或者，所述正向引物如SEQIDNO:10所示，所述反向引物如SEQIDNO:11所示，或者，所述正向引物如SEQIDNO:12所示，所述反向引物如SEQIDNO:13所示；优选地，所述正向引物如SEQIDNO:2所示，所述反向引物如SEQIDNO:3所示。3.一种检测试剂，所述检测试剂包含权利要求1或2所述的引物对。4.如权利要求3所述的检测试剂，其特征在于，所述引物对中，所述正向引物如SEQIDNO:2所示，所述反向引物如SEQIDNO:3所示，或者，所述正向引物如SEQIDNO:6所示，所述反向引物如SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨志行，吴婉欣，宗伟英，王滔，文明，朱冰美，张乐，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院湖州营养与健康产业创新中心，湖州申科生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33