一种用于微生物法定量检测烟酸的微孔板、其试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种用于微生物法定量检测烟酸的微孔板，其由如下步骤制备而成：1)将活化后的植物乳杆菌菌株接种处理，弃去上清液；2)加入10‑12ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液，混匀后离心1‑2min，弃去上清液，重复前述操作一次，混匀，制得菌悬液；吸1‑2ml菌悬液至10‑12ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液中，混匀制成测试菌液；3)将所述测试菌液2‑4μl添加至微孔板各孔中，在低真空环境下稍稍加热测试菌液，使测试菌液在33‑37℃的温度条件下沸腾而产生泡沫，并在所述低真空环境和室温下蒸发干燥36‑48h，或者冷冻后再以升华的方式干燥36‑48h。本发明专利技术还提供包含该微孔板的试剂盒及其制备方法。本发明专利技术降低了试剂盒中的菌种损失，提高了烟酸检测结果的准确性。

Microporous plate used for quantitative detection of nicotinic acid by microbial method, reagent kit and preparation method thereof

The present invention provides a method for microbial microplate method for quantitative detection of nicotinic acid, which comprises the following steps: 1) prepared will be activated after Lactobacillus plantarum strain inoculation treatment, the supernatant was discarded; 2) adding 10 12ml / trehalose sucrose and calcium chloride mixed solution, mixed and centrifuged for 1 2min. The supernatant was discarded, repeating the operation time, mixing, preparing bacterial suspension; absorbing 1 2ml suspension to 10 12ml / trehalose sucrose and calcium chloride in the mixture, mixing into test bacteria; 3) the test bacteria 2 4 L added to microtiter plate the hole, in low vacuum environment slightly heating test bacteria, the bacteria in the test temperature 33 37 DEG C under boiling bubbles, and evaporation drying 36 48h in the low vacuum environment and room temperature, or after freezing by means of sublimation drying 36 48h. The invention also provides a kit containing the microporous plate and a preparation method thereof. The invention reduces the loss of bacteria in the reagent box and improves the accuracy of the detection result of nicotinic acid.

【技术实现步骤摘要】
一种用于微生物法定量检测烟酸的微孔板、其试剂盒及其制备方法
本专利技术涉及一种用于微生物法定量检测烟酸的微孔板、其试剂盒及其制备方法，属于微生物法检测领域。
技术介绍
目前，国内外关于烟酸的检测方法都比较复杂，一般有微生物法、高效液相法和酶联免疫法。其中，高效液相法检测的下限较微生物法要高出很多，精度较好，但是需要昂贵的精密仪器和试剂，样品处理过程较为复杂，难以在生产上进行推广应用；另外，酶联免疫法检测结果与实际数值出入较大。而微生物法可灵敏地检测出具有生物活性的烟酸，这是微生物法区别于其他方法的最大特点及优势。现有的微生物方法利用植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)对烟酸的特异性和灵敏性，定量测定出试样中烟酸的含量。在测定用培养基中供给除烟酸以外的所有营养成分，这样微生物生长产生的透光率就会同标准曲线工作液及未知待测溶液中烟酸的含量相对应；以不同浓度标准溶液的透光率相对于各浓度水平标准物质的浓度绘制标准曲线，根据标准曲线即可计算出试样中烟酸的含量。但是包被有植物乳杆菌的试剂盒却存在诸多缺陷，现有方法在-80℃使微孔板中的微生物悬浮液冷冻休眠，然后将微孔板中的微生物团在真空下冷冻干燥。一些微生物为了适应不利环境，发生变异或重组，因此加入水或样品后，有些微生物在无维生素的条件下仍能生长，导致高检测背景，而且在个别情况下还会导致错误结果。另外，现有方法采用在真空下冷冻干燥，还可导致至少约25％的菌种损失。因此，需要进一步改进微生物方法利用植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)对烟酸检测的方法。
技术实现思路
为了克服上述现有方法的不足，本专利技术提供一种用于微生物法定量检测烟酸的微孔板，可减少菌种损失，提高烟酸的检测结果的准确性。本专利技术的另一目的在于提供上述微孔板的制备方法。本专利技术的还一目的在于提供包含该微孔板的试剂盒。本专利技术的再一目的在于提供一种用于微生物法定量检测烟酸的试剂盒的制备方法。为了实现上述目的，本专利技术所述的一种用于微生物法定量检测烟酸的微孔板，其由如下步骤制备而成：1)活化植物乳杆菌，将活化后的植物乳杆菌菌株接种到乳杆菌肉汤培养基中，32-36℃培养16-20h，2200转/min离心1-2min，弃去上清液；2)加入10-12ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液，混匀后离心1-2min，弃去上清液，重复前述操作一次，然后再加入10-12ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液，混匀，制得菌悬液；吸1-2ml菌悬液至10-12ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液中，混匀制成测试菌液；3)将所述测试菌液2-4μl添加至微孔板各孔中，分别在20mTorr、55mTorr、510mTorr、5Torr、45Torr、210Torr的低真空环境下稍稍加热测试菌液，使测试菌液在33-37℃的温度条件下沸腾而产生泡沫，并在所述低真空环境和室温下蒸发干燥36-48h，或者冷冻后再以升华的方式干燥36-48h。其中，步骤1)中的活化植物乳杆菌采用活化方式：将11g脱脂奶粉加入89ml蒸馏水中，混匀，115℃灭菌15分钟，即为液体培养基；将0.3g粉末植物乳杆菌菌株加入10ml所述液体培养基中，37±1℃培养直至凝乳，得凝乳状菌种，放置于0-4℃保存；将0.3ml上步骤中培养好的凝乳状菌种加入10ml所述液体培养基中，37±1℃培养直至凝乳；重复几次上一步骤，不同的是每次使用的菌种均是上一步骤获得的培养物，待凝乳时间稳定后表明菌种已活化好。所述植物乳杆菌菌株为植物乳杆菌ATCC8014。步骤2)中海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液中，各自的浓度分别为180-190mM、10-12mM。为了实现本专利技术的另一目的，提供一种制备用于微生物法定量检测烟酸的微孔板的方法，其由如下步骤制备而成：1)活化植物乳杆菌，将活化后的植物乳杆菌菌株接种到乳杆菌肉汤培养基中，32-36℃培养16-20h，2200转/min离心1-2min，弃去上清液；2)加入10-12ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液，混匀后离心1-2min，弃去上清液，重复前述操作一次，然后再加入10-12ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液，混匀，制得菌悬液；吸1-2ml菌悬液至10-12ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液中，混匀制成测试菌液；3)将所述测试菌液2-4μl添加至微孔板各孔中，分别在20mTorr、55mTorr、510mTorr、5Torr、45Torr、210Torr的低真空环境下稍稍加热测试菌液，使测试菌液在33-37℃的温度条件下沸腾而产生泡沫，并在所述低真空环境和室温下蒸发干燥36-48h，或者冷冻后再以升华的方式干燥36-48h，从而制得定量检测烟酸用微孔板。其中，步骤1)中的活化植物乳杆菌采用活化方式：将11g脱脂奶粉加入89ml蒸馏水中，混匀，115℃灭菌15分钟，即为液体培养基；将0.3g粉末植物乳杆菌菌株加入10ml所述液体培养基中，37±1℃培养直至凝乳，得凝乳状菌种，放置于0-4℃保存；将0.3ml上步骤中培养好的凝乳状菌种加入10ml所述液体培养基中，37±1℃培养直至凝乳；重复几次上一步骤，不同的是每次使用的菌种均是上一步骤获得的培养物，待凝乳时间稳定后表明菌种已活化好。所述植物乳杆菌菌株为植物乳杆菌ATCC8014。步骤2)中海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液中，各自的浓度分别为180-190mM、10-12mM。本专利技术还提供一种包含上述微孔板的试剂盒。所述试剂盒，还包含烟酸标准品、烟酸测试培养基以及无菌水。具体地说，本专利技术所述试剂盒，包含包被有植物乳杆菌ATCC8014菌株的上述微孔板、3×3.2μg烟酸标准品、3×(0.75-0.76)g烟酸测试培养基(12.0g/L酪蛋白氨基酸、40.0g/L葡萄糖、20.0g/L醋酸钠、0.4g/LL-胱氨酸、0.2g/LDL-色氨酸、20.0mg/L硫酸腺嘌呤、20.0mg/L盐酸鸟嘌呤、20.0mg/L尿嘧啶、200.0μg/L盐酸硫胺素、200.0μg/L泛酸钙、400.0μg/L盐酸吡哆醇、400.0μg/L核黄素、200.0μg/Lp-氨基苯甲酸、0.8μg/L生物素、1.0g/L磷酸氢二钾、1.0g/L磷酸二氢钠、0.4g/L硫酸镁、20.0mg/L氯化钠、20.0mg/L硫酸亚铁、20.0mg/L硫酸锰)以及3×30ml无菌水。本专利技术所述的试剂盒的制备方法，其包括如下步骤：a.先制备包含包被有植物乳杆菌菌株的微孔板：1)活化植物乳杆菌，将活化后的植物乳杆菌菌株接种到乳杆菌肉汤培养基中，32-36℃培养16-20h，2200转/min离心1-2min，弃去上清液；2)加入10-12ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液，混匀后离心1-2min，弃去上清液，重复前述操作一次，然后再加入10-12ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液，混匀，制得菌悬液；吸1-2ml菌悬液至10-12ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液中，混匀制成测试菌液；3)将所述测试菌液2-4μl添加至微孔板各孔中，分别在20mTorr、55mTorr、510mTorr、5Torr、45Torr、210Torr的低真空环境下稍稍加热测试菌液，使测试菌液在33-37℃的温度条件下沸腾而产生泡沫，并在所述低真空环境和室温下蒸发干燥本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于微生物法定量检测烟酸的微孔板，其特征在于，其由如下步骤制备而成：1)活化植物乳杆菌，将活化后的植物乳杆菌菌株接种到乳杆菌肉汤培养基中，32‑36℃培养16‑20h，2200转/min离心1‑2min，弃去上清液；2)加入10‑12ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液，混匀后离心1‑2min，弃去上清液，重复前述操作一次，然后再加入10‑12ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液，混匀，制得菌悬液；吸1‑2ml菌悬液至10‑12ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液中，混匀制成测试菌液；3)将所述测试菌液2‑4μl添加至微孔板各孔中，分别在20mTorr、55mTorr、510mTorr、5Torr、45Torr、210Torr的低真空环境下加热测试菌液，使测试菌液在33‑37℃的温度条件下沸腾而产生泡沫，并在所述低真空环境和室温下蒸发干燥36‑48h，或者冷冻后再以升华的方式干燥36‑48h。

【技术特征摘要】
1.一种用于微生物法定量检测烟酸的微孔板，其特征在于，其由如下步骤制备而成：1)活化植物乳杆菌，将活化后的植物乳杆菌菌株接种到乳杆菌肉汤培养基中，32-36℃培养16-20h，2200转/min离心1-2min，弃去上清液；2)加入10-12ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液，混匀后离心1-2min，弃去上清液，重复前述操作一次，然后再加入10-12ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液，混匀，制得菌悬液；吸1-2ml菌悬液至10-12ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液中，混匀制成测试菌液；3)将所述测试菌液2-4μl添加至微孔板各孔中，分别在20mTorr、55mTorr、510mTorr、5Torr、45Torr、210Torr的低真空环境下加热测试菌液，使测试菌液在33-37℃的温度条件下沸腾而产生泡沫，并在所述低真空环境和室温下蒸发干燥36-48h，或者冷冻后再以升华的方式干燥36-48h。2.根据权利要求1所述的微孔板，其特征在于，步骤1)中的活化植物乳杆菌采用活化方式为：将11g脱脂奶粉加入89ml蒸馏水中，混匀，115℃灭菌15分钟，即为液体培养基；将0.3g粉末植物乳杆菌菌株加入10ml所述液体培养基中，37±1℃培养直至凝乳，得凝乳状菌种，放置于0-4℃保存；将0.3ml上步骤中培养好的凝乳状菌种加入10ml所述液体培养基中，37±1℃培养直至凝乳；重复几次上一步骤，不同的是每次使用的菌种均是上一步骤获得的培养物，待凝乳时间稳定后表明菌种已活化好。3.根据权利要求1所述的微孔板，其特征在于，所述植物乳杆菌菌株为植物乳杆菌ATCC8014。4.根据权利要求1所述的微孔板，其特征在于，步骤2)中海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液中，各自的浓度分别为180-190mM、10-12mM。5.制备权利要求1-4任意一项所述微孔板的方法，其由如下步骤制备而成：1)活化植物乳杆菌，将活化后的植物乳杆菌菌株接种到乳杆菌肉汤培养基中，32-36℃培养16-20h，2200转/min离心1-2min，弃去上清液；2)加入10-12ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液，混匀后离心1-2min，弃去上清液，重复前述操作一次，然后再加入10-12ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液，混匀，制得菌悬液；吸1-2ml菌悬液至10-12ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液中，混匀制成测试菌液；3)将所述测试菌液2-4μl添加至微孔板各孔中，分别在20mTor...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙飞，高天垒，卜庆婧，
申请(专利权)人：北京中检葆泰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11