一种使用磺酰罗丹明B检测皮肤来源细胞活力的方法技术

细胞活力检测是检测化妆品安全性的一个重要方法，皮肤细胞是常用的实验对象，最常使用的检测方法是MTT法。然而MTT法存在一些缺陷，如检测结果不稳定、系统误差比较大、检测效率比较低等。本发明专利技术公开的应用磺酰罗丹明B法(简称SRB法)检测皮肤来源细胞活力，属于细胞生物学检测技术。在选用的角质细胞HaCaT、黑色素细胞B16、成纤维细胞BALB/C 3T3三种皮肤来源细胞中，应用SRB法检测细胞活力，线性范围大、相关性好、检测信号强、系统误差小、信号稳定、重复性比较好、检测效率高。因此，检测皮肤细胞活力时，SRB法具备稳定、精确、灵活、高效的特点，克服了传统MTT法的缺陷，适用于皮肤、化妆品等领域的研究或检验。

A method for detecting activity of skin derived cells using sulfonyl Luo Danming B

Detection of cell viability is an important method to detect the safety of cosmetics. Skin cells are the most commonly used experimental objects. The most commonly used method is MTT. However, there are some defects in MTT method, such as unstable test results, relatively large system errors and low detection efficiency. The invention discloses a method for detecting the vitality of skin derived cells by using the application of the sulfonyl rhodamine B (SRB), and belongs to the cell biology detection technique. In the selection of the HaCaT, B16 melanoma cells, fibroblast BALB/C 3T3 three skin cells, cell viability was detected by SRB method, linear range, correlation coefficient and detection signal, small system error, signal stability, good repeatability, high detection efficiency. Therefore, when detecting the vitality of skin cells, SRB has the characteristics of stability, accuracy, flexibility and efficiency. It overcomes the shortcomings of the traditional MTT method and is suitable for research and testing in the fields of skin, cosmetics and so on.

【技术实现步骤摘要】
一种使用磺酰罗丹明B检测皮肤来源细胞活力的方法
应用磺酰罗丹明B法(简称SRB法)检测皮肤来源细胞活力，属于细胞生物学检测技术，可以应用于皮肤、化妆品等领域的研究或检验。
技术介绍
细胞活力检测是检测化妆品安全性的一个重要方法，皮肤细胞是常用的实验对象，最常使用的检测方法是MTT法。MTT是一种黄色染料，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能将MTT还原为蓝紫色结晶甲瓒，而死细胞无此功能。在一定范围内，甲瓒生成量与活细胞数成正比，溶解后吸光值可间接反映活细胞数量。然而MTT法存在一些缺陷，如：检测结果不稳定；系统误差比较大；检测必须连续做完，无法中途停止，时间灵活性差，检测效率比较低；无法进行重复检测，一旦实验过程中发生意外，无法通过重复检测进行补救等。因此，有必要寻找一种更为稳定、精确、灵活、高效的细胞活力检测方法，克服传统MTT法的缺陷。SRB法是Skehan于1990年建立的一种细胞活力检测方法，并因其具备快速、信号稳定、成本低廉等优点而获得了广泛的应用，尤其是在肿瘤研究领域。SRB是一种粉红色蛋白质结合染料，在弱酸性条件下可与细胞蛋白质中的碱性氨基酸结合，在弱碱性条件下，SRB可被溶解，吸光值反映蛋白质含量，代表细胞数量。但是在化妆品研究领域，SRB法却很少有人使用，也缺乏对SRB法和MTT法应用于皮肤细胞的比较。
技术实现思路
本专利技术提供了SRB法用于检测皮肤来源细胞活力的应用，并证明其是一种批量检测皮肤细胞活力的优先选择方法，能够达到线性范围大、相关性好、检测信号强、系统误差小、信号稳定、重复性好的技术效果。具体地，本专利技术提供了一种检测细胞活力的方法，其特征在于，使用的试剂包括磺酰罗丹明B。在一个具体的实施例中，本专利技术的方法所检测的细胞是皮肤来源的细胞。在一个具体的实施例中，本专利技术的方法所检测的细胞是皮肤来源的细胞系，所述方法的结果用于指导实验室中后续的研究。在一个具体的实施例中，本专利技术的方法所检测的细胞是皮肤来源的细胞系HaCaT、B16或BALB/C3T3。在一个具体的实施例中，本专利技术的方法所检测的细胞是皮肤来源的原代培养细胞，所述方法的结果用于指导实验室中后续的研究。在一个具体的实施例中，本专利技术的方法所检测的细胞是皮肤来源的原代培养细胞，所述方法的结果用于指导临床诊断和治疗。在一个具体的实施例中，本专利技术的方法按照以下步骤进行：(1)细胞接种于96孔板，按照每孔100、300、1000、3000、10000、30000和100000个细胞的梯度浓度进行接种，每个浓度接种4个复孔；(2)细胞贴壁后弃培养基，加入10％三氯乙酸(每孔100μL)，置于4℃冰箱中固定30min，蒸馏水洗板3次后，置于50℃烘箱中干燥；(3)加入SRB染液(每孔100μL)，室温染色20min，然后弃染液，用1％乙酸洗板3次，置于50℃烘箱中干燥；(4)加入10mmol/LTris(每孔150μL)，置于微孔板振荡器上震荡15min后于酶标仪检测OD540。SRB法用于检测皮肤来源细胞活力还具有以下技术效果：(1)过程中可以暂停、从而能够为批量检测积累样本、提高检测效率；(2)SRB法可以进行重复检测。检测皮肤细胞活力时，SRB法具备稳定、精确、灵活、高效的特点，可以作为皮肤细胞活力或毒性检测的方法之一；也可以与MTT法同时使用，互相验证，互为补充，避免使用单一方法的不足；而当检测样品数量较大时，SRB法适合于成批处理的优势则更为明显，是批量检测皮肤细胞活力的优先选择方法。附图说明1.图1，MTT法和SRB法在B16，HaCaT和BALB/C3T3细胞中的线性范围。三种细胞分别接种于96孔板(每孔100-100000个细胞)，细胞贴壁后，分别使用MTT法和SRB法进行检测。横轴为细胞接种数量(细胞数/孔)，纵轴为检测值。2.图2，MTT法和SRB法在三种细胞中的信噪比。B16，HaCaT和BALB/C3T3细胞分别接种于96孔板(每孔20000个细胞)，每种细胞准备20个复孔。细胞贴壁后，分别使用MTT法和SRB法进行检测，分别计算两种方法的信噪比。横轴为细胞系(a：B16细胞；b：HaCaT细胞；c：BALB/C3T3细胞)，纵轴为信噪比。3.图3，MTT法和SRB法在三种细胞中的变异系数。B16，HaCaT和BALB/C3T3细胞分别接种于96孔板(每孔20000个细胞)，每种细胞准备20个复孔。细胞贴壁后，分别使用MTT法和SRB法进行检测，分别计算两种方法的变异系数。横轴为细胞系(a：B16细胞；b：HaCaT细胞；c：BALB/C3T3细胞)，纵轴为变异系数。4.图4，MTT法和SRB法检测信号的衰减情况。MTT法和SRB法检测结束后的不同时间点重新于酶标仪读板，所得信号值与第一次读板数值进行比较。横轴为时间，纵轴为再次读板与第一次读板信号值之比。5.图5，SRB法重复染色。经过SRB法检测的平板，室温放置10天后，使用蒸馏水洗净、晾干，重新进行SRB染色，所获得的信号与第一次检测结果进行比较。横轴为细胞系(a：B16细胞；b：HaCaT细胞；c：BALB/C3T3细胞)，纵轴为重新染色与第一次检测信号值之比。具体实施方式1.材料与方法(1)细胞系。人永生化表皮细胞HaCaT、小鼠黑色素瘤细胞B16、小鼠胚胎成纤维细胞BALB/C3T3均购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。HaCaT细胞培养使用MEM培养基，B16细胞和3T3细胞培养使用DMEM培养基，内加10％胎牛血清，置于含5％CO2的37℃培养箱中培养。(2)主要试剂。MEM和DMEM培养基购自Hyclone，胰酶和PBS购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心，胎牛血清购自Gibco，DMSO、乙酸、三氯乙酸购自国药，Tris购自Amresco。MTT购自北京泰格美科技有限公司，溶解于PBS中，浓度5g·L-1，过滤除菌。SRB购自Sigma，溶解于1％的乙酸中，浓度0.4％。(3)主要仪器。生物安全柜1384(Thermo)，CO2培养箱CO2CELL(德国MMM)，倒置显微镜IX71(OLYMPUS)，离心机TDZ5-WS(湘仪离心机仪器有限公司)，微孔板振荡器MB100-4P(杭州奥盛仪器有限公司)，酶标仪SynergyHT(BioTek)，纯水机Integral3(MLLlPORE)。(4)MTT试验方法。B16，HaCaT和BALB/C3T3细胞分别接种于96孔板，按照每孔100、300、1000、3000、10000、30000、100000个细胞的梯度浓度进行接种，每个浓度接种4个复孔。细胞贴壁后弃培养基，加入含MTT(终浓度0.5g·L-1)的无血清培养基(每孔100μL)。继续培养4小时后弃培养基，PBS洗板一次(每孔150μL)。加入DMSO(每孔150μL)，置于微孔板振荡器上震荡5min后于酶标仪检测OD570。(5)SRB试验方法。B16，HaCaT和BALB/C3T3细胞分别接种于96孔板，按照每孔100、300、1000、3000、10000、30000、100000个细胞的梯度浓度进行接种，每个浓度接种4个复孔。细胞贴壁后弃培养基，加入10％三氯乙酸(每孔100μL)，置于4℃冰箱中固定30mi本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测细胞活力的方法，其特征在于，使用的试剂包括磺酰罗丹明B。

【技术特征摘要】
1.一种检测细胞活力的方法，其特征在于，使用的试剂包括磺酰罗丹明B。2.权利要求1的方法，其特征在于，所述细胞是皮肤来源的细胞。3.权利要求1的方法，其特征在于，所述细胞是皮肤来源细胞系。4.权利要求3的方法，其特征在于，所述皮肤来源细胞系是HaCaT、B16或BALB/C3T3。5.权利要求1的方法，其特征在于，所述细胞是皮肤来源的原代培养细胞。6.权利要求1-5的方法，其特征在于，该方法的步骤如下：(1)细胞接种于96孔板，按照每孔100、300、10...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕冰峰，裴新荣，邢书霞，罗飞亚，崔生辉，王刚力，张庆生，王佑春，
申请(专利权)人：中国食品药品检定研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11