石胆酸酶催化法制备鹅去氧胆酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种石胆酸酶催化法制备鹅去氧胆酸的方法，包括如下步骤：步骤一、酶的提取，从鹅盲肠得到鹅盲肠黏膜液体并离心，接种培养得所需菌种，经过蒸馏水稀释，将稀释液调pH值后捣碎，离心，汲取上清液，即为7α‑羟化酶液，置于‑20℃以下保存，待用。步骤二、催化转化，利用7α‑羟化酶液催化石胆酸，得到鹅去氧胆酸。本发明专利技术利用鹅盲肠黏液培养得到7α‑羟化酶，原料来源广泛，成本低。而且本发明专利技术克服了常规的从鸭胆汁中提取鹅去氧胆酸的思路限制，提供一种合成鹅去氧胆酸的新思路，而且可以利用本发明专利技术的方法，使含石胆酸较高的鹅去氧胆酸不合格产品转化为鹅去氧胆酸合格产品。

Method for preparing goose bile acid by catalyzing enzyme of cholic acid bile

The invention discloses a method for enzymatic preparation of lithocholic acid chenodeoxycholic acid, which comprises the following steps: Step 1, enzyme extraction, goose cecal mucosa and centrifuged liquid from goose cecum, inoculated the strain, distilled water dilution, the dilution of adjusting pH value to centrifugal, draw the supernatant, which was 7 alpha hydroxylase liquid, in below 20 DEG C for preservation. Step two, catalytic conversion, cholic acid using 7 alpha hydroxylase catalyzed by liquid stone, chenodeoxycholic acid. The present invention was cultured 7 alpha hydroxylase using goose cecal mucus, wide material source, low cost. And the invention overcomes the limitation of the idea of extraction of chenodeoxycholic acid from duck bile, provide a new idea of synthetic chenodeoxycholic acid, and can use the method of the invention, the higher the lithocholic acid containing chenodeoxycholic acid unqualified products into chenodeoxycholic acid qualified products.

【技术实现步骤摘要】
石胆酸酶催化法制备鹅去氧胆酸的方法
本专利技术涉及一种化学物质的制备方法，具体涉及一种石胆酸酶催化法制备鹅去氧胆酸。
技术介绍
鹅去氧胆酸(chenodeoxycholicacid，简称CDCA)化学名为3α，7α-二羟基-5β-胆烷酸，分子式C24H40O4，分子量392.58。是1848年首次从鹅胆汁中提取得到的。鹅去氧胆酸具有溶解胆结石的能力和其它药学功能，自上世纪七十年代以来，在临床上被用作治疗胆结石和其它肝胆疾病的药物。近年的研究发现，在溶解胆结石方面，鹅去氧胆酸的同分异构体熊去氧胆酸的临床应用效果更好，且没有副作用。因此，在溶解胆结石药物的临床应用方面，熊去氧胆酸逐渐取代了鹅去氧胆酸。天然熊去氧胆酸来源于熊胆汁，以前是通过杀熊取胆或通过胆汁导流术从熊体内抽提熊胆汁而得到。目前，这种做法已经被国家明令禁止。随着临床应用的需求量不断增加，天然熊去氧胆酸远远不能满足市场需求。通过化学合成方法获得熊去氧胆酸变得越来越重要。近年，以鹅去氧胆酸为原料，合成熊去氧胆酸工艺过程大大简化，成为合成熊去氧胆酸的主要途径。但是，目前制备鹅去氧胆酸的主要思路就是从鸭胆汁、鹅胆汁中提取，对于鹅去氧胆酸的发展有所限制。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种石胆酸酶催化法制备鹅去氧胆酸，为鹅去氧胆酸的制备提供一种新的思路。本专利技术是这样实现的：石胆酸酶催化法制备鹅去氧胆酸的方法，包括如下步骤：步骤一、酶的提取1.1收集刚宰杀家鹅盲肠部分，木片刮取肠黏膜，将得到的鹅盲肠黏膜液体置于离心管中，加少量蒸馏水稀释震荡摇匀后，离心，汲取上清液。1.2无菌环境下，将上述得到上清液接种在含0.1％石胆酸的液态LB培养基上；避光，控制温度15～25℃，接种3～4天后将培养基上长出的菌落重新接种在含1％石胆酸的液态LB培养基上，避光，控制温度15～25℃，培养3～4天，得所需菌种，0～4℃保存在试管斜面培养基上，待用。所述的含0.1％石胆酸的液态LB培养基，是指石胆酸含量为0.1％的体积百分比，选择培养基还含有胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH值7.0～7.2。含1％石胆酸的液态LB培养基，是指石胆酸含量为1％的体积百分比，选择培养基还含有胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH值7.0～7.2。1.3将上述得到菌种，转到三角瓶内含1％石胆酸的液态LB培养基内，避光，控制温度15～25℃，密闭培养3～4天，取出，加入占三角瓶内含1％石胆酸的液态LB培养基的体积的1～2倍量蒸馏水稀释后，将稀释液调pH值至7.0～7.2后置入高速组织捣碎机进行捣碎2～4小时，离心，汲取上清液。1.4收集上述上清液，即为7α-羟化酶液，置于-20℃以下保存，待用。步骤二、催化转化2.1将石胆酸(LCA)投入反应瓶中，加入0.1mol/L的三乙胺-盐酸(1：1)缓冲溶液，三乙胺-盐酸缓冲溶液用量与石胆酸用量比为15：1至25：1mL/g，搅拌下滴加1mol/L氢氧化钠溶液调pH值至7.0～7.2，反应30分钟至完全溶解；2.2加入7α-羟化酶液至上述溶液，继续加入还原型辅酶Ⅱ(NADPH+)；7α-羟化酶液用量与石胆酸用量比为1：1至3：1mL/g，还原型辅酶Ⅱ与石胆酸用量比为1：600至1：400g/g；2.3常温下(15～25℃)，鼓入空气，滴加稀盐酸维持pH值7.0～7.2搅拌反应8小时，高效液相色谱法(HPLC)分析显示石胆酸峰值消失，确认反应完全；2.4加入10mol/L氢氧化钠溶液调pH值至10～11，升温至50℃，搅拌30分钟；2.5加入乙酸乙酯，用50％硫酸调pH值至3～4，进行萃取，静置分去下层水层；将乙酸乙酯通过硅藻土层进行过滤；乙酸乙酯用量与石胆酸用量比为9：1至11：1mL/g；2.660℃下浓缩滤液至滤液体积为加入的乙酸乙酯体积的一半时，加入与滤液体积相同体积的正庚烷，缓慢搅拌，降温至0～5℃，结晶4小时，过滤得到鹅去氧胆酸精品。本专利技术利用7α-羟化酶，将石胆酸转化为鹅去氧胆酸，具体反应原理如下：本专利技术利用鹅盲肠黏液培养得到7α-羟化酶，原料来源广泛，成本低。而且本专利技术克服了常规的从鸭胆汁中提取鹅去氧胆酸的思路限制，提供一种合成鹅去氧胆酸的新思路，而且可以利用本专利技术的方法，使含石胆酸较高的鹅去氧胆酸不合格产品转化为鹅去氧胆酸合格产品。具体实施方式实施例1石胆酸酶催化法制备鹅去氧胆酸的方法，包括如下步骤：步骤一、酶的提取1.1收集刚宰杀家鹅盲肠部分，木片刮取肠黏膜，将得到的鹅盲肠黏膜液体置于离心管中，加少量蒸馏水稀释震荡摇匀后，离心，汲取上清液。1.2无菌环境下，将上述得到上清液接种在含0.1％石胆酸的液态LB培养基上；避光，控制温度15～25℃，接种3～4天后将培养基上长出的菌落重新接种在含1％石胆酸的液态LB培养基上，避光，控制温度15～25℃，培养3～4天，得所需菌种，0～4℃保存在试管斜面培养基上，待用。所述的含0.1％石胆酸的液态LB培养基，是指石胆酸含量为0.1％的体积百分比，选择培养基还含有胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH值7.0～7.2。含1％石胆酸的液态LB培养基，是指石胆酸含量为1％的体积百分比，选择培养基还含有胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH值7.0～7.2。1.3将上述得到菌种，转到三角瓶内含1％石胆酸的液态LB培养基内，避光，控制温度15～25℃，密闭培养3～4天，取出，加入占三角瓶内含1％石胆酸的液态LB培养基的体积的1～2倍量蒸馏水稀释后，将稀释液调pH值至7.0～7.2后置入高速组织捣碎机进行捣碎2～4小时，离心，汲取上清液。1.4收集上述上清液，即为7α-羟化酶液，置于-20℃以下保存，待用。步骤二、催化转化2.1石胆酸(LCA)10g投入反应瓶中，加入0.1mol/L的三乙胺-盐酸(1：1)缓冲溶液200mL，搅拌下滴加1mol/L氢氧化钠溶液调pH值至7.0～7.2，反应30分钟至完全溶解；2.2加入20mL7α-羟化酶液至上述溶液，继续加入0.02g还原型辅酶Ⅱ(NADPH+)；2.3常温下(15～25℃)，鼓入空气，滴加稀盐酸维持pH值7.0～7.2搅拌反应8小时，高效液相色谱法(HPLC)分析显示石胆酸峰值消失，确认反应完全；2.4加入10mol/L氢氧化钠溶液调pH值至10～11，升温至50℃，搅拌30分钟；2.5加入100mL乙酸乙酯，50％硫酸调pH值至3～4，进行萃取，静置分去下层水层；将乙酸乙酯通过硅藻土层进行过滤；2.660℃下浓缩滤液至剩余50mL后，加入50mL正庚烷，缓慢搅拌，降温至0～5℃，结晶4小时，过滤得到鹅去氧胆酸精品8.5g，HPLC分析，纯度99.2％，收率85％。实施例2石胆酸酶催化法制备鹅去氧胆酸的方法，包括如下步骤：步骤一、酶的提取1.1收集刚宰杀家鹅盲肠部分，木片刮取肠黏膜，将得到的鹅盲肠黏膜液体置于离心管中，加少量蒸馏水稀释震荡摇匀后，离心，汲取上清液。1.2无菌环境下，将上述得到上清液接种在含0.1％石胆酸的液态LB培养基上；避光，控制温度15～25℃，接种3～4天后将培养基上长出的菌落重新接种在含1％石胆酸的液态LB培养基上，避光，控制本文档来自技高网...

【技术保护点】
石胆酸酶催化法制备鹅去氧胆酸的方法，其特征在于包括如下步骤：步骤一、酶的提取1.1收集刚宰杀家鹅盲肠部分，木片刮取肠黏膜，将得到的鹅盲肠黏膜液体置于离心管中，加少量蒸馏水稀释震荡摇匀后，离心，汲取上清液；1.2无菌环境下，将上述得到上清液接种在含0.1％石胆酸的液态LB培养基上；避光，控制温度15～25℃，接种3～4天后将培养基上长出的菌落重新接种在含1％石胆酸的液态LB培养基上，避光，控制温度15～25℃，培养3～4天，得所需菌种，0～4℃保存在试管斜面培养基上，待用；1.3将上述得到菌种，转到三角瓶内含1％石胆酸的液态LB培养基内，避光，控制温度15～25℃，密闭培养3～4天，取出，加入占三角瓶内含1％石胆酸的液态LB培养基的体积的1～2倍量蒸馏水稀释后，将稀释液调pH值至7.0～7.2后置入高速组织捣碎机进行捣碎2～4小时，离心，汲取上清液；1.4收集上述上清液，即为7α‑羟化酶液，置于‑20℃以下保存，待用；步骤二、催化转化2.1将石胆酸投入反应瓶中，加入0.1mol/L的三乙胺‑盐酸1：1缓冲溶液，三乙胺‑盐酸缓冲溶液用量与石胆酸用量比为15：1至25：1mL/g，搅拌下滴加1mol/L氢氧化钠溶液调pH值至7.0～7.2，反应30分钟至完全溶解；2.2加入7α‑羟化酶液至上述溶液，继续加入还原型辅酶Ⅱ；7α‑羟化酶液用量与石胆酸用量比为1：1至3：1mL/g，还原型辅酶Ⅱ与石胆酸用量比为1：600至1：400g/g；2.3常温下，鼓入空气，滴加稀盐酸维持pH值7.0～7.2搅拌反应8小时，高效液相色谱法分析显示石胆酸峰值消失，确认反应完全；2.4加入10mol/L氢氧化钠溶液调pH值至10～11，升温至50℃，搅拌30分钟；2.5加入乙酸乙酯，用50％硫酸调pH值至3～4，进行萃取，静置分去下层水层；将乙酸乙酯通过硅藻土层进行过滤；乙酸乙酯用量与石胆酸用量比为9：1至11：1mL/g；2.6 60℃下浓缩滤液至滤液体积为加入的乙酸乙酯体积的一半时，加入与滤液体积相同体积的正庚烷，缓慢搅拌，降温至0～5℃，结晶4小时，过滤得到鹅去氧胆酸精品。...

【技术特征摘要】
1.石胆酸酶催化法制备鹅去氧胆酸的方法，其特征在于包括如下步骤：步骤一、酶的提取1.1收集刚宰杀家鹅盲肠部分，木片刮取肠黏膜，将得到的鹅盲肠黏膜液体置于离心管中，加少量蒸馏水稀释震荡摇匀后，离心，汲取上清液；1.2无菌环境下，将上述得到上清液接种在含0.1％石胆酸的液态LB培养基上；避光，控制温度15～25℃，接种3～4天后将培养基上长出的菌落重新接种在含1％石胆酸的液态LB培养基上，避光，控制温度15～25℃，培养3～4天，得所需菌种，0～4℃保存在试管斜面培养基上，待用；1.3将上述得到菌种，转到三角瓶内含1％石胆酸的液态LB培养基内，避光，控制温度15～25℃，密闭培养3～4天，取出，加入占三角瓶内含1％石胆酸的液态LB培养基的体积的1～2倍量蒸馏水稀释后，将稀释液调pH值至7.0～7.2后置入高速组织捣碎机进行捣碎2～4小时，离心，汲取上清液；1.4收集上述上清液，即为7α-羟化酶液，置于-20℃以下保存，待用；步骤二、催化转化2.1将石胆酸投入反应瓶中，加入0.1mol/L的三乙胺-盐酸1：1缓冲溶液，三乙胺-盐酸缓冲溶液用量与石胆酸用量比为15：1至25：1mL/g，搅拌下滴加1mol/L氢氧化钠溶液调pH值至7.0～7.2，反应30分钟至完全溶解；2.2加入7α-羟化酶液至上述溶液，继续加入还原型辅酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁万超，蒋先曲，
申请(专利权)人：眉山市新功生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51