一种生物法合成(R)‑邻氯扁桃酸的方法技术

本发明专利技术提供了一种生物法合成(R)‐邻氯扁桃酸的方法，其包括如下步骤：将邻氯扁桃腈流加入转化液中，在pH为7.0‐9.0和温度为20‐40℃的条件下反应8‐12h，停止流加并继续反应1‐4h，得到(R)‐邻氯扁桃酸；该转化液中包括含有MG腈水解酶的E.coli工程菌；本发明专利技术由于采用了MG腈水解酶和流加邻氯扁桃腈相结合的方法制备(R)‐邻氯扁桃酸，不仅工艺路线简单、反应条件温和以及没有污染，而且单批次反应(R)‐邻氯扁桃酸的积累浓度高达600mM，ee值大于98％，具有良好的工业化应用前景。

A biological synthesis (R) method o-chloromandelic acid

The present invention provides a biological synthesis method (R) - chloromandelic acid, which comprises the following steps: o-chloromandelic nitrile is added to the stream in the conversion solution, in pH conditions of 7 - 9 and 20 - 40 DEG C temperature under the reaction of 8 - 12h, and continue to stop the flow and reaction 1 4h, get (R) - chloromandelic acid; the conversion solution including E.coli engineering bacteria containing MG nitrilase; the invention adopts the method of MG and adding nitrilase o-chloromandelic nitrile combination preparation (R) - chloromandelic acid, not only simple process, reaction conditions mild and no pollution, and single batch reaction (R) concentration - chloromandelic acid up to 600mM, the EE value is greater than 98%, with good prospects for industrial application.

【技术实现步骤摘要】
一种生物法合成(R)-邻氯扁桃酸的方法
本专利技术属于生物工程
，涉及一种生物法合成(R)‐邻氯扁桃酸的方法。
技术介绍
(R)‐邻氯扁桃酸是一种重要的手性药物中间体，主要用于合成抗血小板聚集药物氯吡格雷。目前，国内外对于(R)‐邻氯扁桃酸的消费量日益增加，市场需求日益增大。(R)‐邻氯扁桃酸的合成方法主要有不对称合成法和光学异构体拆分法两大类，但以光学异构体拆分法为主，通过拆分外消旋的邻氯扁桃酸来获得。但由于光学异构体拆分法需要的手性拆分剂价格昂贵，且拆分后会得到副产物对映体，原子经济性不高。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种生物法合成(R)‐邻氯扁桃酸的方法，该方法的反应条件温和，并且原料邻氯扁桃腈具有较高的转化率。为达到上述目的，本专利技术的解决方案是：一种生物法合成(R)‐邻氯扁桃酸的方法，其包括如下步骤：将邻氯扁桃腈溶液流加入转化液中，在转化pH为7.0‐9.0和转化温度为20‐40℃的条件下反应8‐12h，停止流加并继续反应1‐4h，得到(R)‐邻氯扁桃酸；其中，上述的转化液含有用于分泌MG腈水解酶的E.coli工程菌。MG腈水解酶是由J2315腈水解酶突变而来的，具体来说是突变了两个氨基酸位点，使得MG腈水解酶对于邻氯扁桃腈的催化活力比J2315腈水解酶更高，同时ee值也更高。MG腈水解酶与J2315腈水解酶的不同已在Wang等人在AppliedandEnvironmentMicrobiology,2015,81:24公开的非专利文献《ProteinEngineeringofaNitrilasefromBurkholderiacenocepaciaJ2315forEfficientandEnantioselectiveProductionof(R)‐ο‐ChloromandelicAcid》中报道过。其中，邻氯扁桃腈在流加之前采用溶剂配制成邻氯扁桃腈溶液。溶剂为醇类、酯类、酮类或烷烃类中的一种以上。其中，醇类包括甲醇，乙醇，异丙醇，正丁醇等；酯类包括乙酸乙酯，丁酸甲酯等；酮类包括丙酮等；烷烃类包括正己烷等。邻氯扁桃腈溶液的浓度可以为1‐6M，优选为3‐6M，最优选为5‐6M。在上述的方法中，流加反应的时间为8‐12h，流加之后继续反应的时间为1‐4h，因此，总反应的时间为9‐16h。本专利技术在整个流加过程(8‐12h)中均采用同一流加速度，该流加速度可以为1‐85gL‐1h‐1，优选为5‐50gL‐1h‐1，进一步优选为8‐16gL‐1h‐1，最优选为10gL-1h-1。在申请号为201510334809.2的中国专利中，造成J2315腈水解酶酶活降低的主要因素是扁桃腈，在本专利技术由于需要用有机溶剂溶解邻氯扁桃腈，从而将其配制成溶液进行流加，造成有机溶剂对酶的活性也有影响，这是因为在底物流加过程中，反应液中的有机溶剂浓度不断地增加，导致在流加阶段之后再降速继续流加得意义不大。在本专利技术的优选实施例中，转化pH可以优选为7‐8.5，还可以进一步优选为7.95‐8.10。在本专利技术的优选实施例中，转化温度可以优选为25‐35℃，还可以进一步优选为30℃。在上述步骤中，转化液的制备方法包括如下步骤：(1)、将E.coli工程菌在发酵培养基中进行培养，离心以得到静息细胞；(2)、收集静息细胞，并将其悬浮在pH为7.0‐9.0的缓冲液中，得到转化液。其中，在步骤(1)中，发酵培养基的组分及含量如下：酵母膏10‐80gL‐1、蛋白胨10‐70gL‐1、甘油1‐500mlL‐1、K2HPO424.75gL‐1、KH2PO43.47gL‐1、NaCl1‐10gL‐1、MgCl21‐5gL‐1、ZnCl21‐5gL‐1。在步骤(1)中，培养的条件为：于37℃，pH＝7.2条件下培养，OD600达到30后采用IPTG进行诱导，之后于30℃，pH7.2继续培养16h。在步骤(2)中的转化液中，静息细胞的浓度为5‐500gL‐1，可以优选为10‐200gL‐1，还可以更优选为15‐100gL‐1，可以最优选为20‐50gL‐1。步骤(2)中的缓冲液为NaH2PO4/Na2HPO4缓冲液、KH2PO4/K2HPO4缓冲液、Tris‐HCl缓冲液或其他任何常用pH缓冲液中的任意一种。步骤(2)中还可以添加邻氯扁桃腈的助溶剂，助溶剂为体积分数为1％‐30％的甲醇、体积分数为1％‐30％的乙醇、体积分数为1％‐30％的异丙醇、体积分数为1％‐30％的正己烷或其他任何常用有机溶剂中的任意一种或几种。进一步地，步骤(2)中的缓冲液的浓度还可以为20‐200mM，助溶剂的体积分数还可以为5％‐20％。由于采用上述方案，本专利技术的有益效果是：本专利技术的方法以邻氯扁桃腈为起始原料，利用高密度发酵获得的静息细胞(用于分泌MG腈水解酶)为生物催化剂，并采用具有较高水解活性的MG腈水解酶和邻氯扁桃腈的流加工艺相结合来生产(R)‐邻氯扁桃酸，不仅工艺路线简单、反应条件温和以及没有污染，而且能够通过不断控制邻氯扁桃腈的加入量来实现(R)‐邻氯扁桃酸的高浓度积累，使单批次反应(R)‐邻氯扁桃酸积累浓度高达600mM，ee值大于98％，邻氯扁桃腈转化率大于99％，，从而具有良好的工业化应用前景。总之，相对于拆分法，本专利技术利用邻氯扁桃腈的自消旋特性，通过MG腈水解酶催化水解邻氯扁桃腈，从而一步法即可获得光学纯的R‐邻氯扁桃酸，因此，是一条极具工业价值的工艺路线。附图说明图1为本专利技术的静息细胞催化水解邻氯扁桃腈合成(R)‐邻氯扁桃酸反应进程曲线图。具体实施方式本专利技术公开了一种生物法合成(R)‐邻氯扁桃酸的方法，该方法包括如下步骤：(1)、将用于分泌MG腈水解酶的E.coli工程菌在发酵培养基中进行培养，离心以得到静息细胞；(2)、收集步骤(1)所得的静息细胞，将该静息细胞悬浮于pH为7.0‐9.0的缓冲液中，得到转化液；(3)、将邻氯扁桃腈溶液流加入步骤(2)所得的转化液中，在转化pH为7.0‐9.0和转化温度为25‐40℃的条件下反应8‐12h(即流加阶段)，然后停止流加，继续反应1‐4h(即反应阶段)，得到(R)‐邻氯扁桃酸。其中，在步骤(1)中，MG腈水解酶是用于分泌MG腈水解酶的E.coli工程菌分泌的。MG腈水解酶是由BCJ2315腈水解酶突变而来的，BCJ2315腈水解酶来自BurkholderiacenocepaciaJ2315。关于该E.coli工程菌，请详见Wang等人在AppliedandEnvironmentMicrobiology,2015,81:24公开的非专利文献《ProteinEngineeringofaNitrilasefromBurkholderiacenocepaciaJ2315forEfficientandEnantioselectiveProductionof(R)‐ο‐ChloromandelicAcid》的记载。公众可以联系研究者从而获得该菌株。步骤(1)中的发酵培养基含有以下组分并且每种组分的含量如下(如表1所示)：酵母膏10‐80g/L、蛋白胨10‐70gL‐1、甘油1‐500mlL‐1、K2HPO424.75gL‐1、KH2PO43.47gL‐1、NaCl1‐10gL‐1、MgCl21‐5g本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生物法合成(R)‐邻氯扁桃酸的方法，其特征在于：包括如下步骤：将邻氯扁桃腈溶液流加入转化液中，在转化pH为7.0‐9.0和转化温度为20‐40℃的条件下反应8‐12h，停止流加并继续反应1‐4h，得到(R)‐邻氯扁桃酸；所述的转化液含有用于分泌MG腈水解酶的E.coli工程菌。

【技术特征摘要】
1.一种生物法合成(R)‐邻氯扁桃酸的方法，其特征在于：包括如下步骤：将邻氯扁桃腈溶液流加入转化液中，在转化pH为7.0‐9.0和转化温度为20‐40℃的条件下反应8‐12h，停止流加并继续反应1‐4h，得到(R)‐邻氯扁桃酸；所述的转化液含有用于分泌MG腈水解酶的E.coli工程菌。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述邻氯扁桃腈溶液的浓度为1‐6M，优选为3‐6M，最优选为5‐6M。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：邻氯扁桃腈溶液的流加速度为1‐85gL‐1h‐1；优选地，所述的流加速度为5‐50gL‐1h‐1；更优选地，所述的流加速度为8‐16gL‐1h‐1；最优选地，所述的流加速度为10gL‐1h‐1。4.根据权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述的转化液的制备方法包括如下步骤：(1)、将所述的E.coli工程菌在发酵培养基中进行培养，离心以得到静息细胞；(2)、收集所述的静息细胞，并将其悬浮在pH为7.0‐9.0的缓冲液中，得到所述的转化液。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述的发酵培养基的组分及含量如下：酵母...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏东芝，许向阳，宋在伟，王华磊，
申请(专利权)人：枣庄市杰诺生物酶有限公司，华东理工大学，
类型：发明
国别省市：山东,37