用于克隆全长基因的成套试剂及方法技术

本发明专利技术公开了用于克隆全长基因的成套试剂及方法。本发明专利技术所提供的用于克隆全长基因的成套试剂由接头A和通用引物组成；接头A是由正向链和反向链组成的接头，正向链为序列1所示的单链DNA，反向连为序列2所示的单链DNA，序列2与序列1的第22-37位反向互补；通用引物为序列1的第1-26位所示的单链DNA。实验证明，本发明专利技术的用于克隆全长基因的成套试剂与方法，可以扩增到目的基因的5’和3’末端，即基因全长。同时，本发明专利技术可以同时进行多个目的基因的扩增。本发明专利技术的用于克隆全长基因的成套试剂与方法可以应用于未知基因克隆、启动的扩增、未知侧翼序列的获取、插入位点的鉴定等方面。

Kit and method for cloning a full-length gene

The present invention discloses a kit and a method for cloning a full-length gene. The present invention provides for cloning of full-length gene reagent set by the joint A and primer composition; joint A is composed of forward and reverse joint chain chain chain, positive single stranded DNA shown in sequence 1, single stranded DNA reverse connected as shown in sequence 2, sequence 2 and sequence number 22-37 1 reverse the universal primer is complementary; sequence 1 bit 1-26 shown in single stranded DNA. The experiments show that the complete kit and method for cloning full-length genes can be amplified to the end of 5 'and' 3 'of the target gene, that is, the full length of the gene. At the same time, the invention can simultaneously amplify multiple target genes. The kit and method for cloning full-length genes can be applied to unknown gene cloning, promoter amplification, acquisition of unknown flanking sequences, identification of insertion sites, etc..

【技术实现步骤摘要】
用于克隆全长基因的成套试剂及方法
本专利技术涉及生物
中用于克隆全长基因的成套试剂及方法。
技术介绍
基因是细胞内DNA分子上具有遗传效应的特定核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片段。基因控制蛋白质合成，是不同物种以及同一物种的不同个体表现出不同的性状的根本原因。基因通过DNA复制及细胞分裂把遗传信息传递给下一代，并通过控制蛋白质的合成使遗传信息得到表达。因此，人们对生物体的研究都集中于对于基因功能的研究。而研究基因的功能的前提是要必须获得候选基因，即需要先进行候选基因的克隆。伴随着现代分子生物技术的发展，出现了许多获得新基因的方法和手段，如图谱技术、转座子标签技术、mRNA差异显示技术、二减法技术以及cDNA文库筛选技术等，但上述方法大多具有实验周期长、技术步骤繁琐且工作量大等缺点。cDNA末端快速扩增技术(rapidamplificationofcDNAends,RACE)是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3’末端的有效方法，为目前广泛应用的基因全长克隆的方法。然而，RACE技术中，获得基因的3’端相对比较容易，但是获得基因的5’端就非常困难，经常会有严重的非特异性扩增，增加了很多的克隆筛选的工作。另外，基因5’端的获得，需要购买5’RACE试剂盒，但是不同公司研发的5’RACE试剂盒原理不尽相同，而且价格非常昂贵。目前急需一种可以简单快速克隆基因全长的方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何克隆目的基因的全长。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了用于克隆全长基因的成套试剂。本专利技术所提供的用于克隆全长基因的成套试剂，由接头A和通用引物组成；所述接头A是由正向链和反向链组成的接头，所述接头A的正向链为序列1所示的单链DNA，所述接头A的反向连为为序列2所示的单链DNA，序列2与序列1的第22-37位反向互补；所述通用引物为序列1的第1-26位所示的单链DNA。其中，序列1、2、3和4的从第1位至最后1位的方向均为相应单链DNA的从5’端至3’端的方向。上述成套试剂中，所述接头A的反向链的5’末端可被磷酸化修饰。上述成套试剂中，所述基因的来源可为植物、动物、微生物或病毒。上述成套试剂中，所述接头A和所述通用引物均可独立包装。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了所述接头A或所述通用引物。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了用于克隆全长基因的系统。本专利技术所提供的用于克隆全长基因的系统，包括所述成套试剂和用于克隆全长基因的其他试剂和/或仪器。上述系统中，所述用于克隆全长基因的其他试剂和/或仪器可为提取RNA、合成cDNA第一链或第二链、DNA片段的连接、对含有粘性末端的DNA片段进行末端补平、对DNA片段加dATP、DNA纯化和/或PCR扩增所需的试剂和/或仪器。上述系统中，所述基因的来源为植物、动物、微生物或病毒。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了克隆目的基因的方法。本专利技术所提供的克隆目的基因的方法，包括如下1)-3)：1)以生物总RNA为模板获得双链cDNA；2)对步骤1)的双链cDNA依次进行末端补平、加dATP和连接所述接头A，得到含有接头A的连接产物；3)以步骤2)的连接产物为模板，用目的基因的特异引物和所述通用引物进行PCR扩增，得到目的基因。上述方法中，步骤1)还可包括对所述双链cDNA进行纯化。上述方法中，步骤2)还可包括对所述含有接头A的连接产物进行纯化。上述方法中，所述1)可包括如下11)和12)：11)以生物总RNA为模板进行反转录，获取第一链cDNA；12)以步骤11)的第一链cDNA为模板合成第二链cDNA，得到双链cDNA。上述方法的操作流程图如图2所示。上述方法步骤2)中，所述的末端补平体系可使用NEB公司的QuickBluntingkit进行；所述加dATP的体系可包括：dATP，加A缓冲液，加dATP的聚合酶，所述的dATP的浓度为5mM，所述聚合酶在所述的反应体系中的浓度为0.5U/μl；所述的接头A的连接体系包括：接头A、ATP和连接酶，所述的接头A的浓度为10μM，所述的ATP的浓度为1.7mM，所述连接酶在所述连接体系中的浓度为0.5U/μl。上述方法步骤3)中，所述的PCR体系包括：引物，聚合酶混合物，以及步骤2)中得到的连接产物。所述的引物的浓度为0.2μM，所述聚合酶混合物在所述PCR体系中所占的50％的体积。上述方法所述的RNA可为任何单倍体、二倍体或多倍体生物或非生物材料的来源的RNA，如动物、植物、微生物或病毒的RNA。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了所述成套试剂、所述接头A、所述通用引物或所述系统在基因克隆中的应用。上述应用中，所述基因可来源于植物、动物、微生物或病毒。本专利技术中，申请人提出了一种全新的基因克隆的新技术，即使用人工合成接头，同时进行5’和3’末端扩增，而后进行全长扩增的新技术。实验证明，本专利技术提供的接头分子A，能够连接到双链cDNA片段的两端，运用本专利技术的克隆方法与用于克隆全长基因的成套试剂，成功的扩增到目的基因的5’和3’末端，并进一步成功的扩增到了全长序列。同时，本专利技术可以同时进行多个目的基因的扩增。本专利技术提供了一种方便、高效、特异的基因克隆方法，在未知基因克隆、启动的扩增、未知侧翼序列的获取、插入位点的鉴定等方面均具有广阔的应用前景。附图说明图1为接头A的结构示意图。图2为基因克隆流程示意图。图3为提取的构树叶片总RNA的电泳图。图4为3’端和5’端扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中，泳道M为分子量标准，泳道1为5’端扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果，泳道2为3’端扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。图5为PCR扩增目的基因全长cDNA得到的产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中，泳道M为分子量标准。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本专利技术，而不是为了限制本专利技术的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所述方法如无特别说明均为常规方法，所用核苷酸序列均由上海Invitrogen生物公司合成。所用试剂如无特别说明均为NEB公司的产品，所用水均为超纯水。用用于克隆全长基因的成套试剂克隆目的基因的方法，包括如下1)-3)：1)以生物总RNA为模板获得双链cDNA；2)对步骤1)的双链cDNA依次进行末端补平、加dATP和连接接头A，得到含有接头A的连接产物；3)以步骤2)的连接产物为模板，用目的基因的特异引物和通用引物进行PCR扩增，得到目的基因。其中，用于克隆全长基因的成套试剂，由接头A和通用引物组成；接头A是由正向链和反向链组成的接头，接头A的正向链为序列1所示的单链DNA，接头A的反向连为为序列2所示的单链DNA，序列2与序列1的第22-37位反向互补；通用引物为序列1的第1-26位所示的单链DNA。下面以构树的基因A为例，具体阐述克隆基因全长的方法。实施例1、用于克隆全长基因的成套试剂克隆A1.总RNA的提取本实验中使用构树叶片为实验材料，进行总RNA的提取。提取之后使用1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示。结果表明，所提取本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于克隆全长基因的成套试剂，由接头A和通用引物组成；所述接头A是由正向链和反向链组成的接头，所述接头A的正向链为序列1所示的单链DNA，所述接头A的反向连为为序列2所示的单链DNA，序列2与序列1的第22‑37位反向互补；所述通用引物为序列1的第1‑26位所示的单链DNA。

【技术特征摘要】
1.用于克隆全长基因的成套试剂，由接头A和通用引物组成；所述接头A是由正向链和反向链组成的接头，所述接头A的正向链为序列1所示的单链DNA，所述接头A的反向连为为序列2所示的单链DNA，序列2与序列1的第22-37位反向互补；所述通用引物为序列1的第1-26位所示的单链DNA。2.根据权利要求1所述的成套试剂，其特征在于：所述接头A的反向链的5’末端被磷酸化修饰。3.权利要求1或2所述接头A或所述通用引物。4.用于克隆全长基因的系统，包括权利要求1或2所述成套试剂和用于克隆全长基因的其他试剂和/或仪器。5.根据权利要求4所述的系统，其特征在于：所述用于克隆全长基因的其他试剂和/或仪器为提取RNA、合成cDNA第一链或第二链、DNA片段的连接、对含有粘性末端的DNA片段进行末端补平、对DNA片段加dATP、DNA纯化和/或PCR扩增所需的试剂和/或仪器。6.根据权利要求1或2所述的成...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭献军，沈世华，
申请(专利权)人：中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11