具有α‑半乳糖苷酶活性的蛋白质及其应用制造技术

本发明专利技术公开了具有α‑半乳糖苷酶活性的蛋白质及其应用。本发明专利技术公开的具有α‑半乳糖苷酶活性的蛋白质是如下A1)‑A5)中的任一种：A1)氨基酸序列是序列表中序列1的第92‑817位的蛋白质；A2)氨基酸序列是序列表中序列1的第87‑817位的蛋白质；A3)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；A4)氨基酸序列是序列表中序列5的第87‑831位的蛋白质；A5)氨基酸序列是序列表中序列5的蛋白质。实验证明，本发明专利技术的蛋白质具有α‑半乳糖苷酶活性，本发明专利技术的蛋白质及含有编码蛋白质核酸分子的重组微生物的发酵产物可用于水解含有α‑半乳糖苷键的物质，也可用于制备α‑半乳糖苷酶制剂。

Protein with alpha glycosidase activity galactose and its application

The invention discloses a protein with alpha glycosidase activity galactose and its application. The invention discloses a glycosidase activity of alpha galactose protein is as follows A1 A5)) either: A1) amino acid sequence is sequence 1 in a sequence table ninety-second 817 protein; A2) amino acid sequence is sequence 1 in a sequence table eighty-seventh 817 protein amino acid; A3) the protein sequence is sequence 1 in a sequence table; A4) is a eighty-seventh amino acid sequence sequence 5 in a sequence table 831 protein; A5) amino acid sequence is sequence 5 in a sequence table of protein. The experiment proved that the protein of the invention has the alpha glycosidase activity galactose, the recombinant microorganism protein and encoding nucleic acid molecules containing protein of the fermentation product can be used for the hydrolysis of alpha galactosidase containing key material, can also be used for the preparation of alpha galactosidase diastases.

【技术实现步骤摘要】
具有α-半乳糖苷酶活性的蛋白质及其应用
本专利技术涉及生物
中，具有α-半乳糖苷酶活性的蛋白质及其应用。
技术介绍
α-半乳糖苷酶又称蜜二糖酶，能够水解蜜二糖、棉籽糖、水苏糖等寡糖的末端半乳糖残基。α-半乳糖苷酶来源于植物和细菌、真菌、放线菌、酵母菌等多种微生物。不同来源的α-半乳糖苷酶在基因结构、分子量大小、等电点、催化活性等方面有很大的差异。α-半乳糖苷酶是一种糖蛋白，分子量介于30-400kDa之间，蛋白质和糖基通过共价键连接，其中糖基主要有6-8个甘露糖和乙酰葡萄糖胺单糖组成。该酶的应用领域主要包括以下几个方面：1、在食品行业中的应用。豆类是人们营养的主要蛋白质来源，但由于豆类产品中普遍存在α-半乳糖苷类寡糖的抗营养因子，而人的消化道中又不能产生降解这类寡糖的α-半乳糖苷酶。这类寡糖经过大肠微生物发酵，容易产生胀气，影响营养物质的消化和吸收。在制糖工业中，α-半乳糖苷酶可以用来水解甜菜中的棉籽糖，降低糖蜜粘度，促进蔗糖结晶，提高蔗糖的产量和质量。2、在饲料工业中的应用。在单胃动物饲料中，豆粕和杂粕的中半乳糖苷类寡糖含量很高，被后肠道微生物发酵后，产生胀气、腹泻、厌食等，从而影响营养物质的消化和吸收，进而影响动物生产性能。有研究表明，在肉鸡玉米-豆粕型日粮中添加α-半乳糖苷酶，可以显著提高肉仔鸡生长性能、能量和养分表观代谢率及消化酶的活性。3、在医疗领域中的应用。α-半乳糖苷酶在医疗领域主要用于治疗法布里病、血型转换和制备环糊精衍生物。B型血与O型血的唯一差别在于红细胞表明糖链最外端多出一个以α-1,3糖苷键连接的半乳糖基，可将这个糖基用α-半乳糖苷酶切掉，实现B型血转变成O型血。此外，α-半乳糖苷酶在造纸业中也有一定的应用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种具有α-半乳糖苷酶活性的蛋白质及其相关生物材料。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一种具有α-半乳糖苷酶活性的蛋白质，其名称为galC，galC是如下A1)-A7)中的任一种：A1)氨基酸序列是序列表中序列1的第92-817位的蛋白质；A2)氨基酸序列是序列表中序列1的第87-817位的蛋白质；A3)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；A4)氨基酸序列是序列表中序列5的第87-831位的蛋白质；A5)氨基酸序列是序列表中序列5的蛋白质；A6)将A1)-A5)中任一蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；A7)在A1)-A5)中任一蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1的第92-817位所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签。所述标签可为表1所示标签，但不限于表1中的标签。表1、标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加可为不超过20个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。GhNAC79可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。GhNAC79的编码基因可通过将序列3、序列4的第43-2223位、序列4或序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上标签的编码序列得到。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了与galC相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B10)中的任一种：B1)编码galC的核酸分子；B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；B9)含有B1)所述核酸分子的转基因细胞系；B10)含有B2)所述表达盒的转基因细胞系。上述生物材料中，B1)所述核酸分子可为如下1)-7)中任一种所示的核酸分子：1)序列表中序列3所示的cDNA分子或DNA分子；2)序列表中序列4的第43-2223位所示的cDNA分子或DNA分子；3)序列表中序列4所示的cDNA分子或DNA分子；4)序列表中序列2所示的cDNA分子或DNA分子；5)在1)或2)或3)或4)的核苷酸序列的5′或3′端添加标签的编码序列得到的编码galC的cDNA分子或基因组DNA分子；6)与1)或2)或3)或4)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码galC的cDNA分子或基因组DNA分子；7)在严格条件下与1)或2)或3)或4)限定的核苷酸序列杂交，且编码galC的cDNA分子或基因组DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本专利技术的编码galC的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本专利技术分离得到的galC的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码galC且具有galC功能，均是衍生于本专利技术的核苷酸序列并且等同于本专利技术的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本专利技术的编码galC的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。上述生物材料中，B2)所述的含有编码galC的核酸分子的表达盒(galC基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达galC的DNA，该DNA不但可包括启动galC基因转录的启动子，还可包括终止galC基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用现有的载体构建含有所述galC基因表达盒的重组载体。上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pPICZαA质粒。B3)所述重组载体可含有序列3、序列4的第43-2223位、序列4或序列2所示的用于编码galC的DNA序列。进一步所述重组载体具体可为pPICZαA-galC或pPICZαA-galC-Y。所述pPICZαA-galC为将pPICZαA质粒的EcoRI和XbaI识别序列间的DNA片段替换为序列3所示的DNA分子得到的重组质粒。所述pPICZαA-galC能表达序列1所示的蛋白质。所述pP本文档来自技高网...

【技术保护点】
蛋白质，是如下A1)‑A7)中的任一种：A1)氨基酸序列是序列表中序列1的第92‑817位的蛋白质；A2)氨基酸序列是序列表中序列1的第87‑817位的蛋白质；A3)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；A4)氨基酸序列是序列表中序列5的第87‑831位的蛋白质；A5)氨基酸序列是序列表中序列5的蛋白质；A6)将A1)‑A5)中任一蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；A7)在A1)‑A5)中任一蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

【技术特征摘要】
1.蛋白质，是如下A1)-A7)中的任一种：A1)氨基酸序列是序列表中序列1的第92-817位的蛋白质；A2)氨基酸序列是序列表中序列1的第87-817位的蛋白质；A3)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；A4)氨基酸序列是序列表中序列5的第87-831位的蛋白质；A5)氨基酸序列是序列表中序列5的蛋白质；A6)将A1)-A5)中任一蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；A7)在A1)-A5)中任一蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。2.与权利要求1所述的蛋白质相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B10)中的任一种：B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；B9)含有B1)所述核酸分子的转基因细胞系；B10)含有B2)所述表达盒的转基因细胞系。3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下1)-7)中任一种所示的核酸分子：1)序列表中序列3所示的cDNA分子或DNA分子；2)序列表中序列4的第43-2223位所示的cDNA分子或DNA分子；3)序列表中序列4所示的cDNA分子或DNA分子；4)序列表中序列2所示的cDNA分子或DNA分子；5)在1)或2)或3)或4)的核苷酸序列的5′或3′端添加标签编码序列得到的编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；6)与1)或2)或3)或4)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹云鹤，杨旭，杨勇智，郭贺楠，郭昱含，王剑，王春林，李德发，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11