一种耐干扰素的HBV细胞系模型的建立方法及其在制备抗HBV药物中的应用技术

本发明专利技术公开了一种耐干扰素的HBV细胞系模型的建立方法及其在制备抗HBV药物中的应用，培养HBV体外转染细胞株HepG2.2.15；将低浓度10～70IU·mL

Establishment method of interferon resistant HBV cell line model and its application in preparing anti HBV medicine

The invention discloses a method for establishing an interferon resistant HBV cell line model and its application in preparing an anti HBV drug, culturing HBV transfected cell line HepG2.2.15 in vitro, and placing a low concentration of 10 to 70IU. ML

【技术实现步骤摘要】
一种耐干扰素的HBV细胞系模型的建立方法及其在制备抗HBV药物中的应用
本专利技术涉及一种乙肝病毒的细胞诱导方法，尤其涉及的是一种耐干扰素的HBV细胞系模型的建立方法及其在制备抗HBV药物中的应用。
技术介绍
干扰素IFNα具有抗病毒和免疫调节的双重作用，是目前用于慢性乙型肝炎(CHB)治疗的主要药物之一。近年来开发的长效干扰素，如PEG-IFNα、rHSA-IFNα，克服了普通干扰素半衰期短的缺点，提高了患者的依从性。但不管是普通干扰素还是长效干扰素，长期应用后其抗乙肝病毒HBV、丙肝病毒HCV作用会出现明显下降，肝炎病毒容易对之产生耐药性，如普通IFNα治疗半年后，只有26％的CHB患者获得稳定的疗效，而PEG-IFNα的稳定疗效率也只有29％。rHSA-IFNα对CHB的长期疗效还不确切，但有HCV对rHSA-IFNα产生耐药性的报道。HBV对IFN产生耐药已严重限制了干扰素类药物的使用，对人类战胜HBV带来新的挑战。探索HBV耐干扰素的机制，并寻找相应的干预措施来延缓耐药性的产生，将是恢复干扰素抗HBV作用的关键，而建立耐干扰素的HBV细胞模型又是探索机制和寻找干预措施的关键。HBV耐药是限制IFNα-2b使用的主要因素，建立体外耐药细胞模型是研究耐药机制的重要手段之一。目前建立耐药细胞系的方法主要有体外药物诱导法和耐药基因转染法，其中药物诱导法包括低浓度长期维持法和间歇大剂量冲击逐步增加剂量法。前者是最常见的方法，此法循序渐进，筛选成功的把握较大，建立的耐药株耐药性较稳定，需要时间短。目前国内外还没有建立耐IFN的HBV细胞模型的报道。专利技术内容本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种耐干扰素的HBV细胞系模型的建立方法及其在制备抗HBV药物中的应用，建立HBV耐药细胞系模型。本专利技术是通过以下技术方案实现的，本专利技术包括以下步骤：(1)培养HBV体外转染细胞株HepG2.2.15；(2)将低浓度10～70IU·mL-1的干扰素IFNα-2b加入到细胞株HepG2.2.15中，同时加入遗传霉素G418进行长期诱导12～48wk获得HepG2.2.15/IFNα-2b细胞系模型。所述步骤(1)中，在培养基DMEM中加入80mg·L-1G418、10％胎牛血清，2mmol/L谷氨酰胺，100IU/mL青、链霉素；pH7.2～7.4，所用培养条件为37℃，5％CO2，待细胞长成单层后，0.25％胰蛋白酶消化，每3～4d传代一次，获得HepG2.2.15。所述步骤(2)中，HepG2.2.15细胞计数后分组，培养液中分别加入终浓度为0、10、30、50、70IU·mL-1的IFNα-2b，同时加380mg·L-1G418诱导，培养3～4d，待细胞长满后消化计数再培养，持续诱导培养12～48wk获得HepG2.2.15/IFNα-2b细胞系模型。本专利技术还包括以下步骤：在HepG2.2.15/IFNα-2b细胞系模型中加入最佳药效浓度的干扰素IFNα-2b，确定最佳刺激浓度和刺激时间。所述最佳药效浓度的确定方法如下：取HepG2.2.15细胞消化后计数，配制成3×104个mL-1接种于96孔培养板，2h后待细胞完全贴壁，分别给予不同浓度的IFNα-2b，阴性对照组不给药。继续培养96h，收集细胞上清液，HepG2.2.15细胞分泌标志物HBsAg、HBeAg、HBVDNA的受抑制程度最高的浓度为最佳药效浓度。所述最佳刺激浓度的确定方法如下：取刺激12wk的各组细胞，调整细胞浓度为3×104个mL-1，接种于96孔培养板，每孔100μL，2h后待细胞完全贴壁，移除培养液，加入含有最佳药效浓度的IFNα-2b培养液，96h后收集细胞上清液，比较不同刺激浓度的各组细胞上清液中HBsAg、HBeAg、HBVDNA的变化，从而确定最佳刺激浓度。所述最佳刺激时间的确定方法如下：选取上述最佳刺激浓度分别刺激不同刺激时间的细胞，调整细胞浓度为3×104个mL-1，接种于96孔培养板，每孔100μL，2h后待细胞完全贴壁，移除培养液，加入含有最佳药效浓度的IFNα-2b培养液，96h后收集细胞上清液，比较不同刺激时间的各组细胞上清液中HBsAg、HBeAg、HBVDNA的变化，从而确定最佳刺激时间。一种所述耐干扰素的HBV细胞系模型的建立方法在制备抗HBV药物中的应用。本专利技术相比现有技术具有以下优点：本专利技术工艺路线简单，建立耐干扰素的HBV细胞模型，为进一步探索HBV对干扰素产生耐药的机制提供实验基础，为新型抗HBV药物的筛选和开发提供思路。附图说明图1是IFNα-2b对HepG2.2.15细胞分泌标志物的影响；图2是最佳药效浓度的IFNα-2b对不同刺激浓度的细胞分泌标志物的影响；图3是最佳药效浓度的IFNα-2b对不同刺激时间的细胞分泌标志物的影响。具体实施方式下面对本专利技术的实施例作详细说明，本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。本专利技术的药物和试剂为：干扰素IFNα-2b为安科生物工程股份有限公司产品(安达芬，600万IU·mL-1)，DMEM高糖培养基、胎牛血清为美国Gibicol公司产品，胰蛋白酶为美国Hyclone公司产品，遗传霉素G418为美国Amresco公司产品，ELISA酶联免疫试剂盒、HBV核酸定量检测试剂盒均为上海科华生物技术有限公司产品，其余试剂均为国产分析纯。本专利技术使用的检测仪器为：实时定量PCR(qRT-PCR)仪(美国AppliedBiosystems公司)，EmaxPlus酶标仪，IX51型倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)，3110型水套式CO2培养箱(美国Thermo)公司)。实施例1细胞培养：HBV体外转染细胞株HepG2.2.15细胞系购自上海博冬生物科技有限公司。本实施例所用细胞均为此细胞，所用培养液均为DMEM中加入380mg·L-1G418，10％胎牛血清，2mmol/L谷氨酰胺，100IU/mL青、链霉素，pH7.2～7.4,所用培养条件均为37℃，5％CO2，待细胞长成单层后，0.25％胰蛋白酶消化，每3～4d传代一次。耐药细胞株的诱导：HepG2.2.15细胞计数后分为五组，培养液中分别加入IFNα-2b(终浓度分别为0、10、30、50、70IU·mL-1)，同时加G418(380mg·L-1)诱导，培养3～4d，待细胞长满后消化计数再培养，按此方法持续诱导培养12个月，每个月收集细胞上清液并留取培养细胞冻存。HepG2.2.15细胞是将ayw亚型HBV-DNA导入体外培养的人肝癌细胞系HepG2细胞而获得的转染细胞系，可稳定表达HBV的全部病毒标志，包括乙肝病毒的脱氧核糖核酸HBV-DNA(即乙肝病毒基因)、乙肝表面抗原HBsAg、乙型肝炎病毒e抗原HBeAg、乙型肝炎核心抗原HBcAg等。HepG2.2.15细胞是较成熟的抗HBV研究体外细胞模型，广泛用于HBV感染及药物抗HBV作用及机制等方面的研究。实施例2本实施例用于确定IFNα-2b对HepG2.2.15细胞分泌标志物的影响，比较不同浓度的IFNα-2b对HBsAg、HBeAg、HBVDNA表达的影响，从而确定本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种耐干扰素的HBV细胞系模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)培养HBV体外转染细胞株HepG2.2.15；(2)将低浓度10～70IU·mL

【技术特征摘要】
1.一种耐干扰素的HBV细胞系模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)培养HBV体外转染细胞株HepG2.2.15；(2)将低浓度10～70IU·mL-1的干扰素IFNα-2b加入到细胞株HepG2.2.15中，同时加入遗传霉素G418进行长期诱导12～48wk获得HepG2.2.15/IFNα-2b细胞系模型。2.根据权利要求1所述的一种耐干扰素的HBV细胞系模型的建立方法，其特征在于，所述步骤(1)中，在培养基DMEM中加入80mg·L-1G418、10％胎牛血清，2mmol/L谷氨酰胺，100IU/mL青、链霉素；pH7.2～7.4，所用培养条件为37℃，5％CO2，待细胞长成单层后，0.25％胰蛋白酶消化，每3～4d传代一次，获得HepG2.2.15。3.根据权利要求1所述的一种耐干扰素的HBV细胞系模型的建立方法，其特征在于，所述步骤(2)中，HepG2.2.15细胞计数后分组，培养液中分别加入终浓度为0、10、30、50、70IU·mL-1的IFNα-2b，同时加380mg·L-1G418诱导，培养3～4d，待细胞长满后消化计数再培养，持续诱导培养12～48wk获得HepG2.2.15/IFNα-2b细胞系模型。4.根据权利要求1所述的一种耐干扰素的HBV细胞系模型的建立方法，其特征在于，还包括以下步骤：在HepG2.2.15/IFNα-2b细胞系模型中加入最佳药效浓度的干扰素IFNα-2b，确定最佳刺激浓度和刺激时间。5.根据权利要求4所述的一种耐干扰素的H...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐丙发，韦佳佳，汤波，
申请(专利权)人：安徽医科大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34