一种快速简易的拟南芥完整叶绿体的提取方法技术

本发明专利技术属于细胞生物学、生物化学和分子生物学等技术领域，公开了一种快速简易的拟南芥完整叶绿体的提取方法。其中包括以下操作步骤：(1)将拟南芥叶片在Medium I中低速匀浆；(2)过滤之后1500g 4℃水平离心5min；(3)叶绿体沉淀用Medium II悬浮后，在40％/80％percoll梯度中3000g 4℃水平离心30min。(4)吸出完整叶绿体，用SH buffer洗涤两次；(5)叶绿体沉淀用SH buffer悬浮后色素定量。

A rapid and simple method for extraction of intact chloroplasts of Arabidopsis thaliana

The invention belongs to the technical field of cell biology, biochemistry and molecular biology, and discloses a quick and simple method for extracting complete chloroplasts of Arabidopsis thaliana. Which includes the following steps: (1) the Medium I in Arabidopsis leaves in low speed homogenate; (2) after filtering the 1500g 4 degrees horizontal centrifugal 5min; (3) using Medium II chloroplast suspension precipitation gradient in the 40%/80%percoll, 3000g 4 degrees horizontal centrifugal 30min. (4) from intact chloroplasts, washed two times with SH buffer; (5) using SH buffer suspension after the quantitative precipitation of chloroplast pigment.

【技术实现步骤摘要】
一种快速简易的拟南芥完整叶绿体的提取方法
本专利技术属于细胞生物学、生物化学和分子生物学等
，特别涉及一种快速简易的拟南芥完整叶绿体的提取方法。
技术介绍
拟南芥(Arabidopsisthaliana)，又名鼠耳芥，是目前已知植物基因组中最小的，也是一种应用十分广泛的模式生物。而叶绿体是植物细胞特有的细胞器，是植物进行光合作用的场所，除了光合作用外，还参与氨基酸、脂肪酸、植物生长物质、维生素等的合成。因而，植物叶绿体的发育与功能研究一直倍受人们关注。同时，获得高纯度的叶绿体用于蛋白质功能的研究成为先决条件。目前，关于拟南芥叶绿体提取的方法，大多数由提取菠菜和豌豆叶绿体的方法改进而来。1985年Riet等人的分离方法只用了一种浓度的percoll梯度，得到的叶绿体纯度不够；2008年DanielSalvi的提取方法需要用到较高条件的高速水平离心机。还有一些方法提取液的配方复杂，花费时间长。本专利技术提供了一种快速简易的完整叶绿体提取方法，提取时间短，配方简单，离心要求低，进行定量测定后，可以直接运用于叶绿体膜蛋白、基质蛋白及叶绿体DNA的提取等各种后续研究。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的目的在于提供一种快速简易的完整叶绿体的提取方法。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种快速简易的拟南芥完整叶绿体的提取方法，其特征在于，包括以下操作步骤：(1)用具预冷；(2)在培养箱光周期开始2-3h时，取3-4周的拟南芥叶片，置于冰上；(3)然后在匀浆机中加入200ml的MediumI(缓冲液I)，低速匀浆；(4)使用miracloth(神奇滤布)或者纱布过滤，1500g水平离心5min，沉淀为墨绿色粗叶绿体，上清为浅绿色；(5)尽量去除上清，沉淀用约5ml的MediumII(缓冲液II)轻柔悬浮；(6)配置40％/80％percoll(细胞分离液)梯度，将样品上样至percoll梯度上层，3000g水平离心30min；(7)完整叶绿体位于上下两个percoll组分的交界处，将完整叶绿体吸出；用SHbuffer(SH缓冲液)稀释3倍，1500g水平离心2min，沉淀重悬于25mlSHbuffer，1000g离心1min；(8)沉淀用适量SHbuffer悬浮(约5-10ml)，可以立即镜检观察叶绿体，并色素定量。更为具体地，一种快速简易的完整叶绿体提取方法，包括以下操作步骤：(1)本方法所有用具(组织捣碎匀浆机、烧杯、试管、试剂等)需在冰上或者-20℃预冷，离心均在4℃条件下。(2)在培养箱光周期开始2-3h时，取3-4周的拟南芥叶片共20g，置于冰上。(3)然后在匀浆机中加入200ml的MediumI(缓冲液I)(330mMsorbitol(山梨糖醇)，30mMTricine-KOH(三甲基甘氨酸-氢氧化钾)pH8.4，5mMEGTA，5mMEDTA，10mMNaHCO3)，低速匀浆，时间不宜超过5min。(4)使用3层miracloth(神奇滤布)或者8层纱布过滤至4个50ml圆底离心管中，1500g水平离心5min，沉淀为墨绿色粗叶绿体，上清为浅绿色。(5)尽量去除上清，沉淀用约5ml的MediumII(缓冲液II)(300mMsorbitol(山梨糖醇)，20mMHepes-KOH(4-羟乙基哌嗪乙磺酸-氢氧化钾)pH7.6，5mMMgCl2，2.5mMEDTA)轻柔悬浮(枪头剪大口)。(6)在50ml离心管中配置23ml40％/80％percoll(细胞分离液)梯度，将样品上样至4个percoll梯度上层，3000g水平离心30min。(7)完整叶绿体位于上下两个percoll(细胞分离液)组分的交界处(5ml刻度线)，小心将完整叶绿体吸出，每一个percoll交界处可吸出5-10ml叶绿体。用SHbuffer(SH缓冲液)(330mMsorbitol，50mMHepes-KOHpH8.0，2mMDTT，DTT需现用现加)稀释3倍，1500g水平离心2min，沉淀重悬于25mlSHbuffer，1000g离心1min。(8)沉淀用适量SHbuffer(SH缓冲液)(330mMsorbitol，50mMHepes-KOHpH8.0，2mMDTT，DTT需现用现加)悬浮(约5-10ml)，可以立即镜检观察叶绿体，并色素定量。(Percoll(细胞分离液)梯度配制：首先配制含6％(w/v)sorbitol(山梨糖醇)的100％Percoll(细胞分离液)，然后配制Percoll(细胞分离液)梯度。40％组分，7.2ml100％Percoll+10.8mlSHbuffer；80％组分，4ml100％Percoll+1mlSHbuffer。)与现有技术相比，本专利技术具有以下优点及有益效果：(1)本专利技术不需要将拟南芥暗处理过夜，节省步骤和时间。(2)本专利技术的三个提取液配方简单，但是能提取到大量有活力的叶绿体。(3)本专利技术改进了步骤4、6离心力的大小，大大降低了对离心机的要求。(4)本专利技术改进了步骤6离心的时间，使得获得尽可能多的完整叶绿体。附图说明图1是使用本专利技术提取的拟南芥完整叶绿体图，(注：Bar＝5μm)。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例1一种快速简易的拟南芥完整叶绿体的提取方法(1)本方法所有用具(组织捣碎匀浆机、烧杯、试管、试剂等)需在冰上或者-20℃预冷，离心均在4℃条件下。(2)在培养箱光周期开始2-3h时，取3-4周的拟南芥叶片共20g，置于冰上。(3)然后在匀浆机中加入200ml的MediumI(330mMsorbitol，30mMTricine-KOHpH8.4，5mMEGTA，5mMEDTA，10mMNaHCO3)，低速匀浆，时间不宜超过5min。(4)使用3层miracloth或者8层纱布过滤至4个50ml圆底离心管中，1500g水平离心5min，沉淀为墨绿色粗叶绿体，上清为浅绿色。(5)尽量去除上清，沉淀用约5ml的MediumII(300mMsorbitol，20mMHepes-KOHpH7.6，5mMMgCl2，2.5mMEDTA)轻柔悬浮(枪头剪大口)。(6)在50ml离心管中配置23ml40％/80％percoll梯度，将样品上样至4个percoll梯度上层，3000g水平离心30min。(7)完整叶绿体位于上下两个percoll组分的交界处(5ml刻度线)，小心将完整叶绿体吸出，每一个percoll交界处可吸出5-10ml叶绿体。用SHbuffer(330mMsorbitol，50mMHepes-KOHpH8.0，2mMDTT，DTT需现用现加)稀释3倍，1500g水平离心2min，沉淀重悬于25mlSHbuffer，1000g离心1min。(8)沉淀用适量SHbuffer悬浮(约5-10ml)，可以立即镜检观察叶绿体，并色素定量。(Percoll梯度配制：首先配制含6％(w/v)sorbitol的100％Percoll，然后配制Percoll梯度。40％组分为7.2ml100％Percoll+10.8mlSHbuffer，80％组分为4ml100％Percoll+1mlSHbuffer，5ml的8本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速简易的拟南芥完整叶绿体的提取方法，其特征在于，包括以下操作步骤：(1)用具预冷；(2)在培养箱光周期开始2‑3h时，取3‑4周的拟南芥叶片，置于冰上；(3)然后在匀浆机中加入200ml的Medium I(缓冲液I)，低速匀浆；(4)使用miracloth(神奇滤布)或者纱布过滤，1500g水平离心5min，沉淀为墨绿色粗叶绿体，上清为浅绿色。(5)尽量去除上清，沉淀用约5ml的Medium II(缓冲液II)轻柔悬浮；(6)配置40％/80％percoll(细胞分离液)梯度，将样品上样至percoll梯度上层，3000g水平离心30min；(7)完整叶绿体位于上下两个percoll组分的交界处，将完整叶绿体吸出；用SH buffer(SH缓冲液)稀释3倍，1500g水平离心2min，沉淀重悬于25ml SH buffer，1000g离心1min；(8)沉淀用适量SH buffer悬浮(约5‑10ml)，可以立即镜检观察叶绿体，并色素定量。

【技术特征摘要】
1.一种快速简易的拟南芥完整叶绿体的提取方法，其特征在于，包括以下操作步骤：(1)用具预冷；(2)在培养箱光周期开始2-3h时，取3-4周的拟南芥叶片，置于冰上；(3)然后在匀浆机中加入200ml的MediumI(缓冲液I)，低速匀浆；(4)使用miracloth(神奇滤布)或者纱布过滤，1500g水平离心5min，沉淀为墨绿色粗叶绿体，上清为浅绿色。(5)尽量去除上清，沉淀用约5ml的MediumII(缓冲液II)轻柔悬浮；(6)配置40％/80％percoll(细胞分离液)梯度，将样品上样至percoll梯度上层，3000g水平离心30min；(7)完整叶绿体位于上下两个percoll组分的交界处，将完整叶绿体吸出；用SHbuffer(SH缓冲液)稀释3倍，1500g水平离心2min，沉淀重悬于25mlSHbuffer，1000g离心1min；(8)沉淀用适量SHbuffer悬浮(约5-10ml)，可以立即镜检观察叶绿体，并色素定量。2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，用具预冷包括将组织捣碎匀浆机、烧杯、试管、试剂在冰上或者-20℃预冷。3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述MediumI的配方为：330mMsorbitol，30mMTricine-KOHpH8.4，5mMEGTA，5mM...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭昌操，杨紫薇，刘思雯，朱其金，董甜甜，宋亚男，郑丹菁，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44