本发明专利技术公开了一种解淀粉芽孢杆菌HM‑6及其菌剂的制备方法和应用，涉及农业生物技术领域。本发明专利技术提供了一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)HM‑6，保藏号为CGMCC NO.13627。以及含有此解淀粉芽孢杆菌的菌剂，菌剂的制备方法，还提供了此解淀粉芽孢杆菌及其菌剂的应用。该生防菌株HM‑6具有安全、无毒、无环境污染的特点；菌剂制备方法简单，成本低；HM‑6及其菌剂对玉米鞘腐病的防效达75%以上，且施用简单，可替代或减少化学农药的施用，提高农产品的安全性；同时对玉米大斑病、番茄灰霉病、黄瓜枯萎病、苹果斑点落叶病均有很强的抑制作用。
Preparation and application of Bacillus amyloliquefaciens HM 6 and agent
The invention discloses a Bacillus amyloliquefaciens HM 6 and inoculum preparation method and the application thereof, and relates to the field of agricultural biotechnology. The present invention provides a Bacillus cereus
【技术实现步骤摘要】
解淀粉芽孢杆菌HM-6及其菌剂的制备方法和应用
本专利技术涉及农业生物
，尤其涉及一种防治植物病害的生防菌株及其菌剂的制备方法和应用。
技术介绍
玉米鞘腐病致病菌为层出镰孢菌(Fusariumproliferatum)。该病是近年我国玉米生产上发生的一种新病害。玉米鞘腐病在我国春玉米区均有不同程度发生。该病主要发生在玉米生长后期的籽粒形成直至灌浆充实期。发病严重时，引起玉米秃尖、籽粒干瘪，或者穗腐，造成很大的产量损失。目前该病在我国属新发生病害，并有加重危害趋势，发生规律及防治措施有待深入研究。生物防治对环境污染小，无残留，安全有效，在提倡可持续发展的今天，随着人们生活水平的提高和环保意识的加强，对农产品的质量提出了更高的要求。微生物杀菌剂成为植物病害防治研究的重要方面，具有广泛的应用前景。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种解淀粉芽孢杆菌HM-6及其菌剂的制备方法和应用，该生防菌株HM-6具有安全、无毒、无环境污染的特点；菌剂制备方法简单，成本低；HM-6及其菌剂对玉米鞘腐病的防效达75%以上，且施用简单，可替代或减少化学农药的施用，提高农产品的安全性；同时对玉米大斑病、番茄灰霉病、黄瓜枯萎病、苹果斑点落叶病均有很强的抑制作用。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案是：对采自不同环境土样进行微生物的分离，以玉米鞘腐病病原菌为靶标菌，筛选得到防治效果稳定的拮抗菌HM-6，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。已于2017年01月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCCNo.13627。本专利技术还提供了含有解淀粉芽孢杆菌HM-6的菌剂。含有解淀粉芽孢杆菌HM-6的菌剂的制备方法，包括下述步骤：（1）将解淀粉芽孢杆菌HM-6接种于牛肉膏蛋白胨平板上，在28-32℃下活化1d；（2）转接于牛肉膏蛋白胨培养液中，在28-32℃、120-180rpm的摇床上培养16-20h，得种子液；（3）按体积比为3%-5%的接种量将种子液接种到发酵培养基中，在28-35℃、110-150rpm条件下培养2-3d，得发酵液；（4）发酵液离心，离心得到的固体经冷冻干燥后，得到菌粉；（5）菌粉中加入助剂，制得含有解淀粉芽孢杆菌HM-6的菌剂。优选的，步骤（3）中，发酵培养基的组成成分及其重量百分比为：玉米粉3-5%、豆粕3-5%、氯化钠0.2-0.4%、磷酸二氢钾0.03-0.05%，其余为水；pH值为7.0-7.5。优选的，步骤（5）中，助剂的组成成分及其与菌粉的重量百分比为：蔗糖2.0-2.6％，羧甲基纤维素2.0-3.5%，十二烷基硫酸钠8.0-10.0%，硅藻土36.0-38.0%，菌粉50%。进一步优选的，制得50%可湿性粉剂，活菌数达109-1010CFU/g。本专利技术还提供了解淀粉芽孢杆菌HM-6在防治玉米鞘腐病中的应用。以及解淀粉芽孢杆菌HM-6在防治玉米大斑病、番茄灰霉病、黄瓜枯萎病、苹果斑点落叶病中的应用。本专利技术还提供了解淀粉芽孢杆菌HM-6的菌剂在防治玉米鞘腐病中的应用。以及解淀粉芽孢杆菌HM-6的菌剂在防治玉米大斑病、番茄灰霉病、黄瓜枯萎病、苹果斑点落叶病中的应用。采用上述技术方案所产生的有益效果在于：（1）针对近年来新发病害玉米鞘腐病有加重发生的趋势，造成玉米产量和质量下降，损失严重，又缺乏有效防治措施的现状，本专利技术提供了防治该病效果稳定的生防菌株HM-6并提供了其简单易行的菌剂制备方法和应用技术；（2）本专利技术的菌株HM-6是解淀粉芽孢杆菌，属于目前生物防治中应用较为广泛的芽孢杆菌属成员之一，具有安全、无毒、无环境污染的特点；（3）本专利技术的HM-6菌剂制备方法简单，成本低；（4）实践证明，本专利技术的HM-6菌剂，对玉米鞘腐病具有很好的防治效果。可采用拌种和喷施两种方式。拌种：菌剂500倍液拌种，堆闷4～8小时后直接播种，防效可达75%以上，即便发病，病斑也较小，对产量影响不大。喷施：在发病初期，隔7-10d喷施该菌剂500倍液，连续喷2-3次，其防效可达82.5%。且施用简单，可替代或减少化学农药的施用，提高农产品的安全性；（5）同时本专利技术的HM-6菌剂对玉米大斑病、番茄灰霉病、黄瓜枯萎病、苹果斑点落叶病均有很强的抑制作用。其中，对番茄灰霉病的预防作用防效可达81.3%，治疗作用防效可达72.5%。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明；图1是本专利技术实施例3中HM-6对玉米鞘腐病原菌的抑制效果图；图2是本专利技术实施例3中HM-6对番茄灰霉病原菌的抑制效果图；图3是本专利技术实施例3中HM-6对玉米大斑病原菌的抑制效果图。具体实施方式实施例1HM-6的分离、筛选与鉴定（1）HM-6的分离：不同生境采集土样，称取土壤10g放入盛有90ml无菌水的三角瓶，充分振荡20min，静置10min，再吸菌液逐级稀释得10-5和10-6的菌悬液，吸取0.2ml菌悬液至牛肉膏蛋白胨平板上，涂布均匀，每个稀释度重复三次，置于28℃生化培养箱中培养24h，挑取菌落特征不同的单菌落进行划线分离纯化，接入斜面，得到不同的菌株，进行编号并记录菌落特征，置于4℃冰箱保存备用。（2）HM-6的筛选：采用平板对峙培养的方法进行初筛。将玉米鞘腐病菌在PDA平板上培养后，用打孔器取直径为0.6cm的菌盘，置于PDA平板的中央，将在牛肉膏蛋白胨平板上活化过的菌株划线接至距病原菌2cm处，每个处理重复3次，在25℃培养箱中培养4d。观察有无抑菌带产生，并记录抑菌带大小，将产生抑菌带的菌株作为拮抗菌进行复筛。采用活体测试法进行复筛。将初筛获得的拮抗菌接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在30℃、150rpm下培养48h，得菌悬液备用。玉米种子在25℃下催芽，播种于装有灭菌珍珠岩的营养钵中，定期喷洒营养液，当株高约30cm时，进行实验测试。将玉米鞘腐病菌在PDA平板上培养后，用打孔器取直径为0.6cm的菌盘，长有菌丝的一面紧贴于叶鞘，用胶带小心固定到玉米叶鞘上。每株接种2个，待叶鞘处出现典型病斑后喷拮抗菌菌悬液，并设清水对照，每个处理10株。置于温室培养，观察记录发病状况，进行统计分析，计算防效。期间每隔一天每个营养钵加入20mL的营养液。通过上述方法筛选得到防治效果稳定的HM-6。（3）HM-6的鉴定：通过对HM-6进行培养特征观察、显微观察、革兰氏染色、16SrDNA全序列分析、系统发育分析等研究，结果初步鉴定其为解淀粉芽孢杆菌。形态特征：牛肉膏培养基上生长初期，菌落呈白色，边缘光滑，有突起，水润透明，不产色素。生长后期菌株呈乳白色，边缘呈小波浪状，有明显的突起，褶皱，不产色素，呈黏稠状。PDA培养基上生长初期与牛肉膏上相似，后期转为黄褐色，边缘光滑，突起不明显，菌落外缘有透明圈。通过染色在显微镜下观察，细胞短杆状，具有运动性，周生鞭毛，芽孢直径小于菌体、中生，革兰氏染色呈阳性。分子生物学鉴定：将提取的拮抗菌HM-6基因组DNA进行16SrDNA的PCR扩增。PCR扩增的引物27F：5’GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’；1492R：5’CGGCTACCTTGTTACG本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种解淀粉芽孢杆菌(
【技术特征摘要】
1.一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)HM-6，保藏号为CGMCCNO.13627。2.含有如权利要求１所述的解淀粉芽孢杆菌HM-6的菌剂。3.如权利要求2所述的含有解淀粉芽孢杆菌HM-6的菌剂的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：（1）将解淀粉芽孢杆菌HM-6接种于牛肉膏蛋白胨平板上，在28-32℃下活化1d；（2）转接于牛肉膏蛋白胨培养液中，在28-32℃、120-180rpm的摇床上培养16-20h，得种子液；（3）按体积比为3%-5%的接种量将种子液接种到发酵培养基中，在28-35℃、110-150rpm条件下培养2-3d，得发酵液；（4）发酵液离心，离心得到的固体经冷冻干燥后，得到菌粉；（5）菌粉中加入助剂，制得含有解淀粉芽孢杆菌HM-6的菌剂。4.根据权利要求3所述的含有解淀粉芽孢杆菌HM-6的菌剂的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，发酵培养基的组成成分及其重量百分比为：玉米粉3-5%、豆粕3-5%...
【专利技术属性】
技术研发人员：张雪辉，唐蕊，
申请(专利权)人：邢台学院，
类型：发明
国别省市：河北,13
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