具有抗三七根腐病作用的细菌及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种细菌Pseudomonas aeruginosa PAO1 strain PAO1，为铜绿假单胞菌PA01 Pseudomonas aeruginosa PAO1，其保藏号为CCTCC NO：M 2016575。本发明专利技术还同时公开了上述细菌Pseudomonas aeruginosa PAO1 strain PAO1的用途：预防三七根腐病的发生。

Bacteria having 37 root rot resistance and uses thereof

The invention discloses a bacteria Pseudomonas aeruginosa PAO1 strain PAO1, Pseudomonas aeruginosa PA01 Pseudomonas aeruginosa PAO1, its preservation number is CCTCC NO:M 2016575. The invention also discloses the application of the bacterial Pseudomonas aeruginosa PAO1 strain PAO1: 37 to prevent root rot.

【技术实现步骤摘要】
具有抗三七根腐病作用的细菌及其用途
本专利技术涉及一种具有抗三七根腐病作用的细菌及其作用--有效的预防三七根腐病的发生。
技术介绍
三七(学名：Panaxnotoginseng)为五加科人参属植物，在我国已有400多年的栽培历史，其作为一种名贵中药，具有化瘀止血、消肿止痛等功效，三七的药理作用主要体现在对血液系统、心血管系统、脑血管系统、神经系统、代谢、免疫调节系统等的影响。三七又名田七、滇三七、参三七、血参、田三七等。三七已有很多年的药用历史，其根、茎、叶、花均可入药，是复方丹参滴丸、云南白药、片仔癀、复方三七口服液等常见中药制剂的主要成分之一，目前以三七为配方进入《国家基本药物目录》和《国家中药保护品种目录》的制剂达20余种。作为我国传统的名贵药材，三七生物学特性方面的研究也已十分详实。三七的市场需求正逐步增加，但就目前而言，三七的野生资源非常有限，而且采挖野生三七会破坏自然环境的生态平衡，三七资源远远不能满足人们需求；最主要的是在不同的地区三七药材的质量差别非常大。因此通过大棚内大批量种植三七就会解决这一系列的问题。但是，在大棚内大批量种植三七会受到根腐病的影响，根腐病在各个季节都有发生，其发病比较集中在8月份，它的危害常常导致三七产量、质量降低，严重者甚至全园绝收。由于连年大面积单一种植，加之三七为多年生草本植物，性喜温暖阴湿，因此病害问题十分突出，特别是根腐病问题，目前已成为限制三七种植业发展的严重障碍，根腐病常年发病率一般在5％～20％，严重的可损失70％以上。对该病的防治目前主要依靠轮作倒茬和化学药剂灌根。但轮作年限一般要求8年以上，生产上难以大面积推行。药剂灌根虽有效，但农药残留问题严重。对于用细菌来作用于三七根腐病的防治研究并没有相关报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种细菌--PseudomonasaeruginosaPAO1strainPAO1，该菌株可预防三七根腐病的发生。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种细菌PseudomonasaeruginosaPAO1strainPAO1，为铜绿假单胞菌PA01PseudomonasaeruginosaPAO1，其保藏号为CCTCCNO：M2016575。本专利技术还同时提供了上述细菌PseudomonasaeruginosaPAO1strainPAO1的用途：预防三七根腐病的发生。该菌株PseudomonasaeruginosaPAO1strainPAO1是从半夏植株中采用平板稀释法分离得到一株细菌，经鉴定其对由病原菌G3B引起的三七根腐病有拮抗作用。具体分离方法为：1)、将半夏经表面消毒处理后，加入无菌水进行研磨稀释，涂布于营养琼脂上，于28～32℃培养1～3天；营养琼脂配方：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl5g，琼脂18g和蒸馏水1000mL，pH＝7.2～7.4。2)、挑取单菌落于相同的营养琼脂平板划线纯化，于28～32℃培养1～3天；3)、重复步骤2)，直至获得纯培养物。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此。实施例1、拮抗菌(PseudomonasaeruginosaPAO1strainPAO1)的分离培养方法，依次进行以下步骤：1、采集浙江省的半夏植株，洗净后25KHz超声波处理5分钟；2、在无菌条件下，对步骤1所得的供试材料用灭菌去离子水冲洗3次，并依次用75％(v/v)的酒精和3％(m/V)次氯酸钠溶液表面消毒；3、在无菌环境中，继续将步骤2所得供试材料用无菌水冲洗3次，取100μl最后1次冲洗的无菌水冲洗液涂布接种于营养琼脂上，30℃培养24h后，进行无菌验证。如无菌落产生，则继续后续的步骤4；如有菌落产生，则返回步骤2继续表面消毒处理。4、在超净台中，取处理好的半夏样品1～2g，在无菌研钵中充分研磨，并加入5mL无菌水，混匀，静置15min，取100μl上清稀释涂布于营养琼脂培养基中，置于28～32℃(较佳30℃)培养1～3天；5、挑取步骤4中所产的单菌种于相同培养基划线纯化分离，置于28～32℃(较佳30℃)培养1～3天，继续挑取单菌落；重复上述操作直至得到纯培养为止。实施例2、拮抗菌(PseudomonasaeruginosaPAO1strainPAO1)的初筛，依次进行以下步骤：1、拮抗菌的初筛在平板上进行，采用平板对峙培养方法进行筛选：用打孔器沿着病原真菌菌丝生长旺盛的地方打孔获得菌碟。2、将植物病原菌G3B的菌碟接种到PDA培养皿的中央，在其四周与植物病原菌G3B等距约3cm的四个点上，粘上直径为7mm的滤纸四片，每片滤纸上点接上10μl的供试菌(浓度约为108cfu/ml)。所述供试菌为实施例1中分离纯化出来的所有细菌。上述植物病原菌G3B来源于CCTCC，其保藏号为：CCTCCAF2016007。3、设置只接种病原菌的培养皿为空白对照组，每个处理三个重复，然后置于22℃的培养箱中培养7-10d，观察和测量植物病原真菌的菌落直径。实施例3、拮抗菌(PseudomonasaeruginosaPAO1strainPAO1)的复筛，根据初筛结果，将筛选出来的对病原菌G3B具有较强拮抗效果的细菌作为供试菌株，进一步进行复筛，依次进行以下步骤：1、拮抗菌的初筛在平板上进行，采用平板对峙培养方法进行筛选：用打孔器沿着病原真菌菌丝生长旺盛的地方打孔获得菌碟。2、将植物病原菌的菌碟接种到PDA培养皿的中央，在其四周与植物病原菌等距约3cm的四个点上，粘上直径为7mm的滤纸四片，每片滤纸上点接上10μl的供试菌(浓度约为108cfu/ml)。3、设置只接种生防菌或者只接种病原菌的培养皿为空白对照组，每个处理三个重复，然后置于22℃的培养箱中培养7-10d，观察和测量植物病原真菌的菌落直径。4、测量抑菌条带并按下列公式计算抑制率：菌丝生长抑制率(％)＝(单独培养菌落半径－对峙培养菌落半径)/单独培养菌落半径×100。所得的结果如下表1所示。表1、PseudomonasaeruginosaPAO1strainPAO1菌丝生长抑制率将上述复筛所得的菌株PseudomonasaeruginosaPAO1strainPAO1进行保藏，保藏信息具体如下：保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏名称：铜绿假单胞菌PA01PseudomonasaeruginosaPAO1，保藏号为CCTCCNO：M2016575，保藏日期2016.10.18。实施例4、拮抗菌(PseudomonasaeruginosaPAO1strainPAO1，即保藏号为CCTCCNO：M2016575的铜绿假单胞菌PA01PseudomonasaeruginosaPAO1)的三七切片复筛，依次进行以下步骤：1、菌液制备：①病原真菌G3B菌液制备：将从三七病根分离的病原真菌G3B，在PDA固体斜面培养基上活化，22℃恒温培养箱培养7～14d，用无菌ddH2O洗下孢子并制成107cfu/mL病原菌悬浮液。②接抗菌液制备：用无菌水将培养24h的斜面生长(培养条件为30℃恒温培养箱培养2d)的拮抗细菌洗下，制成拮抗菌悬液；拮抗菌悬液中拮抗菌浓度为108cfu/mL。本文档来自技高网...

【技术保护点】
细菌Pseudomonas aeruginosa PAO1 strain PAO1，其特征是：为铜绿假单胞菌PA01 Pseudomonas aeruginosa PAO1，其保藏号为CCTCC NO：M 2016575。

【技术特征摘要】
1.细菌PseudomonasaeruginosaPAO1strainPAO1，其特征是：为铜绿假单胞菌PA01PseudomonasaeruginosaPAO1，其保藏号...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡秀芳，米春意，裴聪，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33