回收再折叠蛋白质的方法，包括使变性蛋白质的浓缩溶液与再折叠稀释剂静态混合以得到再折叠蛋白质。本方法尤其适于大规模处理体积的微生物产生的重组蛋白质。通过从微生物宿主分离蛋白质并将它们暴露于变性剂，可以得到变性的蛋白质溶液。将该溶液与适合的再折叠稀释剂在与所述蛋白质的正确折叠相容的静态混合条件下混合，从而得到所述再折叠蛋白质，优选快速并且高产率地得到。用于实现再折叠蛋白质回收方法的系统包括静态混合器、与该静态混合器相配并且处于其上游的导管，和所述静态混合器上游导管的入口，以及任选地，所述静态混合器下游的动态的、优选非湍流的混合容器。本发明专利技术可尤其用于大规模生产蛋白质，尤其是重组蛋白质。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术处于蛋白质化学的一般领域中。更具体地，本专利技术涉及用于再折叠(refolding)通过重组技术产生的蛋白质的方法和系统。2. 相关技术重组蛋白质的典型的商业生产方案涉及转化细胞，通常细菌细胞， 如大肠杆菌(￡. co/z),以产生通常为哺乳动物来源的外源产物。将编 码所述蛋白质的基因插入到宿主细胞中并通过正常的细胞介导的产生 翻译成对应的蛋白质。然而，细菌宿主细胞可能不能正确折叠这种重组 蛋白质，因为它缺乏哺乳动物细胞中存在的环境和细胞器来进行这种折 叠。结果，细胞可能产生未折叠或者不正确折叠蛋白质的团聚体。当以 高浓度产生时，未折叠和部分折叠的蛋白质可能开始形成不溶性团聚体 或者称作包含体的团聚的、不溶性实体。这些团聚体聚集在周质空间中 并且有时候可以占细菌细胞总蛋白质50 %以上。包含体的大部分由目的 蛋白质组成(有时产生超过90%的纯化蛋白质)，使得它已经是高度纯 化的，小分子、宿主细月包蛋白质和核酸组成包含体的剩余部分。尽管有通常发生的错折叠，在大肠杆菌细胞而不是哺乳动物细胞中 产生重组蛋白的优点是细菌细胞容易得到，生长更快并且可以过量产生 目的蛋白质。它们也不能藏匿可以在哺乳动物细胞中发现的某些病毒。 于是，已经尝试从大肠杆菌纯化和再折叠蛋白质，从而使得产品更经济 和对于人体注射更安全。例如，从团聚体或者包含体分离蛋白质后，纯化蛋白质的第一步是 将其用强盐浓度，例如，6M盐酸胍(GuHCL)或8M尿素溶解。两种盐 都是离液剂，它们通过破坏将包含体维持在一起的氲键和疏水相互作用 而4吏蛋白溶解和解3斤叠。参见，例长口， Ladisch, Michael R, Bioseparations Engineering: Principles, Practice and Economics (2001) John Wiley and Sons, Inc., 118-123。此外，可能需要还原试剂如二石危苏糖醇、半胱氨酸 或者卩-巯基乙醇破坏在蛋白质的产生中错误连接的二硫键。随后用再 折叠緩冲液(可能含有环氧改组试剂以帮助二硫键形成)稀释或者透析解折叠的蛋白质溶液以减小变性剂浓度，使得蛋白质能用它的固有化学 结构再折叠。在再折叠步骤中产物损失的主要途径是团聚。当分离的蛋白质之间 的吸引力比蛋白质和溶质之间的吸引力更有利时，发生团聚。随后有利 的分子内残基-残基吸引(其帮助再折叠蛋白质成它的天然状态)与不 利的分子间吸引力竟争，导致可溶的团聚体。这些可溶的团聚体然后积 累并导致不溶性团聚体的沉淀。尽管团聚有时是可逆反应，但是试图再 折叠团聚体是不希望的，因为这增加生产时间和成本。所以， 一旦之前 团聚或者聚集的蛋白质被溶解，通常避免进一步团聚。迄今为止，蛋白质再折叠和团聚的详细机理是复杂的并且仍有待讨论。已知再折叠不在一个步骤中发生；相反，随着变性剂被除去，蛋白 质发生不连续的构象改变。在这些未折叠和折叠状态之间的中间构象 下，再折叠、团聚或者错折叠(产物损失的另一途径)途径发生竟争。 蛋白质的环境条件和固有的化学结构帮助指示哪个竟争途径将在再折 叠期间占优势。通过改变蛋白质-溶质混合物的环境条件，包括蛋白质浓度、变性 剂浓度和局部温度，已经进行了在再折叠期间避免团聚的尝试。例如， 已经发现团聚反应的动力学在蛋白质浓度方面处于比折叠反应更高的 级另'J(Kiefhaber, T., Rudolph, R., Kohler, H,H., Buchner, J. "Protein Aggregation in vivo: A Quantitative Model of the Kinetic Competition Between Folding and Aggregation." Sz'o/Tec/zwo/ogy, 1991, 9, 825-829)。 对于该反应，通常在相对于溶解度极限的稀释条件下进行再折叠。在此 类条件下，分子相互作用的机会和吸引的可能性被减小。在实验上，蛋白质也显示出在中间变性剂浓度下，在再折叠期间倾 向于团聚。当处于中间构象时，蛋白质可以具有暴露的区域，其具有在 它的疏水残基处团聚的可能性，如上所述。如果变性剂除去或者减少太 慢，那么再折叠可能失败。此外，对蛋白质的热胁迫将增加再折叠期间.蛋白质团聚的可能性。 似乎对于许多蛋白质在低温下团聚反应被抑制，而对于报道在较高温度 下再折叠的其他蛋白质，团聚可能不是重要的途径。该再折叠/团聚行为 的机理还没有被最终建立。它可以是由于涉及蛋白质之间非极性表面屏 蔽的疏水力的温度依赖性(参见，例如，Baldwin, R丄.Temperaturedependance of the hydrophobic interaction in protein folding.尸toc. A/ 〃. 爿c^/.1986， 83, 8069-8072)或者倾向于团聚的中间体的另一单独的途径。从有关再折叠期间团聚的知识，浓缩的物质需要与稀释剂緩沖液快 速混合以避免任何局部的高蛋白质浓度、高变性剂浓度和高温区域。当 前的实验步骤涉及在无挡板槽中使用斜叶搅拌器(pitched blade impellor) 来快速混合浓缩形式的溶解蛋白质与稀释剂緩冲液。该类型的动力混合 器是工业中用于剧烈混合的最常用装置。最初将混合器设置在以湍流速 度搅拌以在稀释剂緩冲液中诱导涡流。然后对准该涡流或者直接对准高 速搅拌器的滴管緩慢递送浓缩的蛋白质溶液。然而，已经证明按比例放大该机械混合器是有困难的。研究已经表 明在混合不是湍流的低搅拌速度下，形成分离的混合区(Makino, T., Ohmura, H., Kataoka, K. Observation of Isolated Mixing Regions in a Stirred Vessel, Jow/-""/ CTzemz.ca/ ￡Vzg/"ee"> g 2001, 34 「5」，574-578)。在这些区域中，蛋白质被过度浓缩并且有团聚的危险，如上 所述。然后将以高湍流速度搅拌该溶液以避免在再折叠期间分离的混合 区。然而，考虑到亚声速脉冲引起的大量的来自搅拌器的剪切力和叶片 后缘附近局部的空泡形成，蛋白质可能随着该方法^f皮放大而经历更高的 机械变性胁迫。参见，例如，Fennema, OR. 1996. Food Chemistry.第三 版.Marcel Dekker, Inc., New York.第6章。此外，高搅拌速率向该系 统中产生高功率输入，从而可能通过功率损耗对所述蛋白质产生热变性 胁迫。用于大规模产生蛋白质，尤其是重组蛋白质的改进的蛋白质再折叠 方法，包括改进的混合方案将是所希望的。专利技术概述本专利技术通过提供再折叠蛋白质的方法解决了这些需要，所述方法包 括静态混合变性蛋白质的浓缩溶液与再折叠稀释剂以得到与所述再折 叠蛋白质的混合物。该方法尤其适于大规模加工体积，如30L或者以上， 例如高达200或者1000或甚至10,000L中的樣i生物产生的重组蛋白质。 通过从微生物宿主分离蛋白质并将它们暴露于变性剂中，可以得到变性 蛋白质溶液。将该溶液在与所述蛋白质的正确折叠相容的混合条件下本文档来自技高网...
【技术保护点】
再折叠蛋白质的方法，其包括： 提供变性蛋白质的浓缩溶液；和 使所述变性蛋白质与再折叠稀释剂静态混合以得到包含再折叠蛋白质的混合物。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：R圣约翰，J卢克，T乐，
申请(专利权)人：诺瓦蒂斯有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]
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