抗苗勒管激素抗体及其制备方法技术

本发明专利技术提供抗苗勒管激素抗体及其制备方法。通过选用适当位置和长度的氨基酸序列作为免疫抗原免疫动物，并进一步通过优化抗体制备过程，从而得到抗AMH抗体。本发明专利技术的抗AMH抗体不能与全长AMH中不稳定的26‑59位之间的氨基酸序列结合，从而增强免疫反应强度，大大提高检测灵敏度。

Anti Mullerian hormone antibody and preparation method thereof

The present invention provides an anti Mullerian hormone antibody and a preparation method thereof. By selecting the proper position and length of amino acid sequence as immune antigen to immunize animals, and further optimizing the antibody preparation process, anti AMH antibodies can be obtained. Instability of the anti AMH antibody could not with full-length AMH in 26 59 between the amino acid sequence of combination, so as to enhance the immune response strength, greatly improve the detection sensitivity.

【技术实现步骤摘要】
抗苗勒管激素抗体及其制备方法
本专利技术涉及免疫
，具体地涉及一种抗苗勒管激素抗体及其制备方法。
技术介绍
抗苗勒管激素(anti-Mullerianhormone,AMH)是由睾丸未成熟支持细胞和卵巢生长卵泡的颗粒细胞分泌的一类单糖蛋白，隶属于转化生长因子β超家族，具有抑制雄性苗勒管发育、调节两性生殖细胞和性腺发育的重要功能。近年来，各国学者对其在女性生殖领域的作用进行了广泛的研究。在女性，AMH可以调节卵泡发育、反映卵巢储备功能、预测卵巢对超排卵的反应性，对生殖内分泌疾病的研究有一定的价值。目前，关于免疫法检测AMH的记载有许多。例如，美国专利7,897,350记载了检测样本中AMH的组合物和方法，其中抗体结合AMH的成熟区或C端区。欧洲专利公开2161579记载了用于检测或定量样本中至少一种AMH的生物活性形式，例如切断的AMH或C端AMH的方法以及与其结合的抗体。另外，也有一些其他出版物中公开了抗AMH的N端区的抗体。例如，Hudsonetal.(1990)J.Clin.Endocrin.Metab.70:16-22描述了一种免疫分析技术，其中两种单克隆抗体分别针对AMH的前体和N端区。Longetal.(2000)J.Clin.Endocrin.Metab.85:540-544描述了一种免疫分析技术，其也使用了两种单克隆抗体，一种结合AMH的N端表位，另一种结合AMH的C端区。此外，WO2014204327A1中也公开了一种抗AMH的N端区的抗体，其中N端区指人前肽的1-451个残基或者在除去前导序列时为25-451个残基。然而，当利用上述抗AMH抗体检测抗原时，存在检测稳定性差且灵敏度低的问题。
技术实现思路
本专利技术人发现，AMH成熟肽(第26-560位氨基酸残基)N端区(结构稳定区)中前34个氨基酸残基在体内环境下相对不稳定，容易发生水解。因此，当选用AMH成熟肽，特别是其N端区作为抗原制备抗体时，由于前34个氨基酸残基的不稳定性，致使得到的抗体，特别是多克隆抗体针对前34个氨基酸的反应性较弱，进一步地，引起当使用此类抗体进行检测时的检测灵敏度大大降低。为了解决至少部分上述技术问题，本专利技术人通过选用适当位置和长度的氨基酸片段作为抗原，并进一步通过优化抗体制备过程，从而得到产生抗AMH抗体，基于此完成了本专利技术。具体地，本专利技术包括以下内容。本专利技术的一方面，提供一种抗AMH抗体，其特异性结合片段由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列组成，或特异性结合片段为由其中的部分序列组成的片段(本文也称作“部分片段”)，且所述片段不包含SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述部分片段选自由SEQIDNO:3-5所示的氨基酸序列组成的片段。本专利技术的另一方面，提供抗AMH抗体的制备方法，其包括用免疫抗原免疫动物的步骤，其中所述免疫抗原由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列组成。在某些实施方案中，抗AMH抗体的制备方法进一步包括使免疫后的动物的脾细胞与同系骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞的步骤。在某些实施方案中，抗AMH抗体的制备方法进一步包括利用筛选抗原筛选阳性细胞株的步骤。在某些实施方案中，使用免疫抗原与用于将其分离的凝胶的混合物直接免疫动物。优选使用SDS-PAGE凝胶与免疫抗原的混合物。在某些实施方案中，本专利技术的抗AMH抗体具有更高的检测灵敏性和检测稳定性。在某些实施方案中，本专利技术的抗AMH抗体对于待检测样品具有更低的要求。例如，不需要为了避免抗原的水解而对样品进行额外处理。例如，不需要向样品中添加蛋白酶抑制剂。在某些实施方案中，本专利技术的抗AMH抗体的制备方法能够一次性同时制备针对不同表位的多种单克隆抗体。在某些实施方案中，本专利技术优化了制备抗体的步骤，减少了筛选次数，提高了单克隆抗体细胞株的制备效率，降低了生产成本。在某些实施方案中，本专利技术的免疫抗原具有更高的免疫原性，能更强烈地刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分化，最终产生相应抗体和致敏淋巴细胞。附图说明图1纯化抗体12％SDS-PAGE胶图。具体实施方式通过解释以下本申请的优选实施方案，本专利技术的其他目的和优点将变得清楚。应理解本专利技术中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本专利技术。另外，对于本专利技术中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本专利技术内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本专利技术所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本专利技术仅描述了优选的实验方法、测定或测试方法，但是在本专利技术的实验、测定或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法或实验。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。本专利技术中，名词术语既包括单数形式，也包括复数形式，除非上下文另行明确指出。本专利技术中所述的“至少之一”或“至少一种”不仅仅指包含“一个”或“一种”的情况，更重要的还包含“多个”或“多种”的情况。本专利技术中，术语“细胞”、“细胞株”和“细胞培养物”可互换使用，且所有这类的命名都包括子代。因此，术语“转化子”或“转化细胞”包括原代受试细胞和由其产生的培养物，而不考虑传代的次数。还要理解的是，所有子代由于有意或非有意突变而可能在DNA含量上并不能完全一致。与原始转化细胞中筛选出的具有相同功能的突变子代包括在内。本专利技术中，术语“细胞株”是指单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群体。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。从培养代数来讲，本专利技术的细胞株可培养到40-50代。从细胞株的来源来讲，其可以是任何哺乳动物细胞或人工处理细胞，例如融合细胞。优选地，本专利技术的细胞株为小鼠来源。本专利技术中，术语“免疫抗原”是指全长AMH序列(SEQIDNO:6)中除去第1-59的氨基酸片段(SEQIDNO:2)后的片段，即，由第60-560的氨基酸组成的片段。在某些实施方案中，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。在其它实施方案中，其氨基酸序列可具有突变，所述突变包括通过人工方法引入的突变，还包括由于天然原因引入的突变。特别需要说明的是本专利技术的免疫抗原不包括第1-18的信号肽片段、第19-25的前导肽片段以及第36-59的成熟肽N端不稳定区域。本专利技术中，术语“特异性结合片段”是指能够与本专利技术的抗AMH抗体特异性结合的片段。其来源并不特别限定，例如，可以来源于大鼠、小鼠、人等哺乳动物。在某些实施方案中，所述特异性结合片段即为免疫抗原本身。在某些实施方案中，特异性结合片段为免疫抗原的一部分(本专利技术中也称作“部分片段”)。在某些实施方案中，部分片段选自由SEQIDNO:3-5所示的氨基酸序列组成的片段。其中，SEQIDNO:3对应于AMH全长序列中的第76-398AA(即，高度同源的超家族区域)；SEQIDNO:4对应于AMH全长序列中的第462-560AA(即，TGF-B超家族区域)；SEQIDNO:5对应于AMH全长序列中的第76-243AA。本本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗AMH抗体，其特异性结合片段由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成或由其中的部分序列组成，且所述片段不包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种抗AMH抗体，其特异性结合片段由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列组成或由其中的部分序列组成，且所述片段不包含SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的抗AMH抗体，其中所述部分序列选自由SEQIDNO:3-5所示的氨基酸序列。3.根据权利要求1或2所述的抗AMH抗体，其为多克隆抗体。4.根据权利要求1或2所述的抗AMH抗体，其为单克隆抗体。5.一种抗AMH抗体的制备方法，其包括用免疫抗原免疫动物的步骤，其中所述免疫抗原由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列或其部分序列组成。6.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘玲，张明程，
申请(专利权)人：刘玲，
类型：发明
国别省市：四川,51