一种结合Cry2Ad的环七肽及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种结合Cry2Ad的环七肽及其编码基因和应用，属于生物技术领域。本发明专利技术的结合Cry2Ad的环七肽由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列构成。所述结合Cry2Ad的环七肽的编码基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术的结合Cry2Ad的环七肽及其衍生物可以在Cry2Ad定性、定量检测中应用，可替代ELISA检测中的检测抗体应用于夹心和竞争ELISA免疫检测。本发明专利技术结合Cry2Ad的环七肽可以人工合成，简化了制备过程，节约了成本，具有广泛的应用前景。

A cyclic seven peptide combined with Cry2Ad and its coding gene and Application

The invention discloses a ring seven peptide combined with Cry2Ad and a coding gene and an application thereof, belonging to the technical field of biology. The amino acid sequence with Cry2Ad the invention of the ring seven peptide shown by the SEQ ID NO.2. The combination of DNA sequence of Cry2Ad gene encoding seven ring peptide as shown in SEQ ID NO.1. The combination of the Cry2Ad ring seven peptide and the derivative thereof can be applied in the qualitative and quantitative detection of Cry2Ad and can replace the detection antibodies in the ELISA detection for sandwich and competitive ELISA immunoassays. The invention can be synthesized by combining the ring seven peptide of Cry2Ad, simplifies the preparation process, saves the cost, and has wide application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种结合Cry2Ad的环七肽及其编码基因和应用
本专利技术涉及一种环七肽，尤其涉及一种结合Cry2Ad的环七肽及其应用，属于生物

技术介绍
近十年，苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensi,Bt)转基因作物商品化种植推广迅速，研究发现长期大面积种植后会造成杀虫基因逃逸，生物多样性下降以及对非目标生物的间接危害等风险，同时对土壤和水体生态系统也存在潜在的风险，因此，在进行转基因作物研究、开发和商业化的同时，必须建立恰当的方法对粮食及环境中转基因成分进行快速鉴定与检测。目前，转基因产品的检测技术主要有基于核酸检测的多种新型PCR技术和基于蛋白质的免疫检测，其中免疫检测以其准确、经济、便捷等优势已成为快速检测类应用最为广泛的方法，市场上用于检测Bt毒素的免疫试剂盒大多数是采用以多克隆或单克隆抗体为检测元件，其免疫过程比较繁琐，且受个体和免疫过程的影响较大。噬菌体展示技术可以克服上述缺点，该技术是对含有数以亿计克隆的随机片段进行快速高通量地筛选，获得的阳性克隆可被用于分子识别、快速检测试剂开发等领域。目前利用该技术获得的针对Cry1类毒素蛋白的单链抗体和纳米抗体在Bt毒素检测方面也已得到初步应用。但是基因工程抗体货架期较短，其合成受到氨基酸序列长度和空间结构的限制，因此有一定的制约，而噬菌体肽库很好的避开了上述的瓶颈，因此该技术的应用对开发Cry2Ad检测试剂具有广阔的前景。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种结合Cry2Ad的环七肽及其编码基因和应用。为解决上述问题，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的结合Cry2Ad的环七肽，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。所述结合Cry2Ad的环七肽的编码基因。所述编码基因的DNA序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术的结合Cry2Ad的环七肽的衍生物，所述的衍生物为将所述的结合Cry2Ad的环七肽采用异硫氰酸荧光素(FITC)或5-羧基荧光素(5-FAM)等荧光标记物进行标记得到的检测元件。本专利技术的结合Cry2Ad的环七肽或其衍生物在Cry2Ad定性、定量检测中的应用。本专利技术以Cry2Ad为靶分子，将靶分子和BSA分别固相包被于酶标板上，先将噬菌体环七肽库投入BSA包被的板上进行负筛选，再将未结合的肽库与靶分子进行结合、洗脱，重复以上过程至特异性七肽明显富集，最终获得1个结合肽，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术还涉及上述特异性抗Cry2Ad环七肽氨基酸序列的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术提及的环七肽可以通过噬菌体噬菌体扩增、基因工程重组表达及人工合成的方式进行制备。噬菌体噬菌体扩增是通过生物扩增的方式大量增殖展示有结合Cry2Ad的环七肽噬菌体粒子。基因工程重组表达是通过将结合Cry2Ad的环七肽基因与表达载体重组后进行表达。人工合成是通过化学合成多肽的方式进行制备。本专利技术还涉及结合Cry2Ad环七肽的衍生物。是指对多种制备方法获得的结合Cry2Ad的环七肽进行修饰的产物，主要包括异硫氰酸荧光素(FITC)或5-羧基荧光素(5-FAM)等荧光基团检测标签。本专利技术还涉及结合Cry2Ad的环七肽及其衍生物在免疫学检测中的应用。本专利技术结合Cry2Ad的环七肽及其衍生物可替代ELISA检测中的检测抗体应用于夹心和竞争ELISA免疫检测。本专利技术所述的结合Cry2Ad的环七肽及其衍生物在粮食样品中检测应用，其具体步骤为：(1)将500mg固体待测样品干燥磨粉过筛，加入1mL提取液(含0.15％(v/v)吐温20的磷酸缓冲液(PBS))4℃振荡2h后10000g离心10分钟取上清待测。(2)将10μg/mL小菜蛾刷状缘膜囊泡(BrushBorderMembraneVesicles,BBMV)包被到96孔板中，每孔100μL，4℃过夜；次日洗涤后每孔加200μLMPBS(含3％脱脂奶粉PBS)室温孵育1.5h，再次洗涤后加入100μL步骤(1)制备的待测液，37℃孵育1h，PBST(含0.05％吐温20的PBS)洗涤3次，加入100μL1011pfu七肽噬菌体上清液，37℃孵育1h后洗涤，再加入1:5000倍稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗-M13噬菌体二抗孵育1h，洗涤后每孔加入100μL四甲基联苯胺(TMB)显色液，避光显色至蓝色加入50μL2M硫酸终止显色。(3)96孔板在酶标仪上测定OD450nm，将检测结果代入公式y＝0.1503ln(x)+0.8995，R2＝0.997，计算Cry2Ad的浓度。本专利技术从公开的环七肽库中，筛选获得一种具有特异性识别Cry2Ad毒素的七肽，可用于该毒素的检测。有益效果：本专利技术具有下述有益效果：1.本专利技术结合Cry2Ad的环七肽及其衍生物可以替换抗体作为检测元件，避免多克隆或单克隆抗体制备时的动物免疫，对比基因工程抗体更方便体外合成且货架期长。2.本专利技术结合Cry2Ad的环七肽及其衍生物可以和Cry2Ad毒素特异性结合，检测效果好，对开发快速检测试剂盒有重要的科学及现实意义。3.本专利技术结合Cry2Ad的环七肽可以人工合成，简化了制备过程，节约了成本，具有广泛的应用前景。附图说明图1为以结合Cry2Ad的环七肽建立的夹心ELISA标准曲线。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步的说明。本专利技术的结合Cry2Ad的环七肽，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术的结合Cry2Ad的环七肽可以通过噬菌体扩增、基因工程重组表达及人工合成的方式进行制备。噬菌体扩增是指利用噬菌体侵染大肠杆菌后释放出大量展示有环七肽的噬菌体；基因工程重组表达是指将该环七肽基因连接在表达载体后大量表达；人工合成是指利用环七肽的氨基酸序列化学合成。实施例中所涉及的试剂和培养基配方：(1)LB液体培养基：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，用去离子水定容至1L，在15psi高压下蒸汽灭菌20min。(2)LB固体培养基：在1L的LB液体培养中加入15g琼脂，在15psi高压下蒸汽灭菌20min。(3)PBS溶液：称氯化钠8g，十二水合磷酸氢二钠2.9g，氯化钾0.2g，磷酸二氢钾0.2g，充分溶解后定容至1L。(4)PBST溶液：在PBS溶液中加入体积比为0.05％的吐温20。(5)PEG/NaCl溶液：称20gPEG8000,氯化钠14.61g，定容到100mL，在15psi高压下蒸汽灭菌20min。(6)CBS溶液：碳酸钠1.59g，碳酸氢钠2.94g，定容到1L，在15psi高压下蒸汽灭菌20min。(7)TMB溶液：10g四甲基联苯胺溶于1mL二甲基亚砜中。(8)底物显色液：9.875mLCPBS，100μLTMB溶液，25μL体积比为20％H2O2。(9)TBS溶液：1mol/LTris/HCl(pH7.5)10mL,氯化钠8.8g定容到1L，在15psi高压下蒸汽灭菌20min。(10)TBST溶液：TBS溶液中加入不同体积比的吐温20。(11)MPBS溶液：3％(w/v)脱脂奶粉溶于PBS溶液中。(12)环七肽库、-96gⅢ测序引物和E.CoilER2738购于NEB公司。实施例1.结合Cry2Ad的环七肽的淘选及鉴定1.结合Cry2Ad的环七肽亲和淘选具体方法：a本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种结合Cry2Ad的环七肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种结合Cry2Ad的环七肽，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。2.如权利要求1所述结合Cry2Ad的环七肽的编码基因。3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因的DNA序列如SEQIDNO.1所示。4.一种如权利要求1所述的结合Cry2Ad...

【专利技术属性】
技术研发人员：王耘，
申请(专利权)人：金陵科技学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32