一种通过光调控精确检测线粒体内铜离子的荧光探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种通过光调控精确检测线粒体内铜离子的荧光探针及其制备方法和应用，属于有机荧光探针领域。所述的荧光探针为Mito‑Cu

Fluorescent probe for accurate detection of copper ion in mitochondria by light regulation and preparation method and application thereof

The invention relates to a fluorescent probe for accurately detecting copper ions in mitochondria through light regulation, a preparation method and an application thereof, belonging to the field of organic fluorescent probes. The fluorescent probe for Mito Cu

【技术实现步骤摘要】
一种通过光调控精确检测线粒体内铜离子的荧光探针及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种通过光调控精确检测线粒体内铜离子的荧光探针及其制备方法和应用，属于有机荧光探针领域。
技术介绍
在线粒体中，铜离子是一个重要的微量元素,是一系列重要生理酶中不可分割的一部分,如运输和催化功能的酶。当线粒体内的铜离子失衡会破坏线粒体呼吸链，会表现出活性氧簇化合物含量升高、线粒体膜电位下降、脂质过氧化、细胞色素c的释放等一系列细胞凋亡的征兆。铜离子和蛋白质的相互作用也被视为神经变性疾病的信号，如帕金森和阿尔茨海默病。对线粒体内Cu2+的精确检测，有助于我们进一步了解铜离子在神经退行性疾病中的起到的作用，有助于增进我们对线粒体内铜离子生理过程的了解，为神经疾病病理的研究提供一个线粒体内铜离子可视化工具。线粒体在生命中的重要角色，促使它一直作为科学研究中的重中之重。在线粒体的研究中，多以荧光探针主，一个理想的荧光探针是无数个科学家的梦想，至今已经报道出来了很多荧光探针，如检测活性氧簇、活性氮簇、金属离子，生物小分子等的荧光探针，但是这些荧光探针都存在一个致命的缺点就是在经过细胞质靶向线粒体的过程中不能避免来自细胞质内的被检测物的干扰，造成研究结果缺乏说服力。为了解决这一存在已久的问题，急需研发一种可以定位线粒体又能避免细胞质内被检测物的荧光探针。
技术实现思路
为了解决以上的问题，本专利技术提供一种可定位活细胞中线粒体，并通过光调控精确检测线粒体内铜离子的荧光探针及其制备方法和应用。本专利技术采用的技术方案是：一种通过光调控精确检测线粒体内铜离子的荧光探针，所述的荧光探针为Mito-Cu2+荧光探针，Mito-Cu2+荧光探针的结构式如(Ⅰ)所示：本专利技术采用的另一技术方案是：所述的通过光调控精确检测线粒体内的铜离子荧光探针的制备方法，所述的Mito-Cu2+荧光探针的制备方法包括如下步骤：将荧光素衍生化合物和三苯基膦依次加入到甲苯中，加热回流8-16小时，冷却抽滤，除去溶剂，经硅胶柱层析提纯得到目标产物Mito-Cu2+荧光探针，反应式如下：优选的，所述荧光素衍生化合物和三苯基膦的摩尔比为1:1.2-2。优选的，所述的荧光素衍生物的制备方法如下：(1)将荧光素溶解在甲醇中，滴加的水合肼，回流8-14小时，除去溶剂，经硅胶柱层析提纯得到荧光素酰肼；(2)将荧光素酰肼和2-硝基苄溴溶到DMF中，加入碳酸铯常温6-13个小时，水洗萃取，经硅胶柱层析提纯得到光保护荧光素酰肼；(3)将光保护荧光素酰肼和1，4-二溴丁烷溶到DMF中，加入碳酸铯和碘化钾常温反应10-24个小时，水洗萃取，经硅胶柱层析提纯得到荧光素衍生物。优选的，所述步骤(1)中荧光素与水合肼的质量比为1:4.2-5。优选的，所述步骤(2)中荧光素酰肼、2-硝基苄溴和碳酸铯的摩尔比为1:1-1.5:4。优选的，所述步骤(3)中光保护荧光素酰肼、1，4-二溴丁烷和碳酸铯的摩尔比为1:1.2-1.5:4。本专利技术采用的另一技术方案是：一种通过光调控精确检测线粒体内铜离子荧光探针的应用，所述的荧光探针可应用于生理体系中精确检测线粒体内的铜离子。有益效果：本专利技术的荧光探针具有较好的线粒体靶向性、化学稳定性、生物兼容性和铜离子选择性。激光共聚焦成像实验表明该探针具有较好的细胞通透性，对细胞和生物体无毒副作用。本专利技术的荧光探针在可应用于细胞体系中通过光调控精确检测线粒体内的铜离子而避免来自细胞质中铜离子的干扰的应用。本专利技术的精确测线粒体内铜离子的荧光探针可用于活细胞线粒体铜离子的精确检测，主要用的活细胞为Hela细胞株、MCF-7细胞株或者RAW264.7细胞株。附图说明图1是实施例1制备的Mito-Cu2+(5uM)UV光照5分钟后对不同Cu(NO3)2浓度Hepes缓冲溶液(0.2uM-20uM)的荧光光谱图。图2是实施例1制备的Mito-Cu2+(5uM)UV光照5分钟后对20uMCu(NO3)2浓度Hepes缓冲溶液不同响应时间的荧光光谱图。图3是实施例1制备的Mito-Cu2+(5uM)UV光照5分钟后对20当量不同金属离子浓度Hepes缓冲溶液的荧光光谱图。图4是实施例1制备的Mito-Cu2+(5uM)在细胞线粒体中的共聚焦显微成像。具体实施方式实施例1通过光调控精确测线粒体内铜离子的荧光探针的制备方法如下：(1)荧光素酰肼的制备：将1g荧光素溶解在50mL甲醇中，滴加4mL的水合肼，回流10小时，除去溶剂，经硅胶柱层析提纯得到荧光素酰肼；(2)光保护荧光素酰肼的制备：将108mg荧光素酰肼和82mg2-硝基苄溴溶到3mLDMF中，加入405mg碳酸铯常温6个小时，水洗萃取，经硅胶柱层析提纯得到光保护荧光素酰肼；(3)光保护荧光素衍生物的制备：将光保护荧光素酰肼253mg和1，4-二溴丁烷131.7mg溶到4mLDMF中，加入碳酸铯664.4mg和碘化钾催化量常温反应12个小时，水洗萃取，经硅胶柱层析提纯得到荧光素衍生物。1HNMR(300MHz,CDCl3):δ8.02(d,J＝4.8Hz,1H),7.92(d,J＝1.5Hz,1H),7.75(m,1H),7.58(t,J＝4.5Hz,1H),7.42(m,3H),7.00(t,J＝3.9Hz,1H),6.69(s,1H),6.62(d,J＝9.9Hz,1H),6.51(d,J＝6.9Hz,5H),6.03(t,J＝3.3Hz,1H),3.98(t,J＝3.45Hz,2H),3.66(s,2H),3.46(t,J＝3.75Hz,2H),2.03(m,2H),1.92(m,2H),1.69(d,J＝3.9Hz,3H).13CNMR(75MHz,CDCl3):δ166.36,160.00,158.37,153.14,150.92,147.47,138.70,134.27,132.92,129.76,128.75,128.57,128.49,128.24,127.52,124.88,123.81,123.30,122.92,112.70,112.47,112.13,111.44,110.60,103.15,101.68,71.84,67.24,65.30,33.32,29.46,27.82,23.63.(4)Mito-Cu2+荧光探针的制备：将摩尔比1:1.2的荧光素衍生化合物和三苯基膦依次加入到甲苯中，加热回流12个小时，冷却抽滤，除去溶剂，经硅胶柱层析提纯得到目标产物Mito-Cu2+荧光探针。1HNMR(300MHz,DMSO-d6):δ8.05(d,J＝4.8Hz,1H),7.74(m,17H),7.55(m,3H),7.48(s,1H),6.95(d,J＝3Hz,1H),6.41-6.50(s,1H),6.59(m,2H)6.53(m,3H),5.59(d,J＝3.9Hz,1H),4.42(bs,2H),4.06(t,J＝3.45Hz,2H),3.69(t,J＝6.75Hz,2H),1.91(m,2H),1.72(m,2H),1.65(d,J＝3.9Hz,3H).13CNMR(75MHz,DMSO-d6):δ165.49,159.03,157.46,152.13,151.00,147.39,136.87,134.85,本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过光调控精确检测线粒体内铜离子的荧光探针，其特征在于，所述的荧光探针为Mito‑Cu

【技术特征摘要】
1.一种通过光调控精确检测线粒体内铜离子的荧光探针，其特征在于，所述的荧光探针为Mito-Cu2+荧光探针，Mito-Cu2+荧光探针的结构式如(Ⅰ)所示：2.一种如权利要求1所述的通过光调控精确检测线粒体内的铜离子荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的Mito-Cu2+荧光探针的制备方法包括如下步骤：将荧光素衍生化合物和三苯基膦依次加入到甲苯中，加热回流8-16小时，冷却抽滤，除去溶剂，经硅胶柱层析提纯得到目标产物Mito-Cu2+荧光探针，反应式如下：3.根据权利要求2所述的通过光调控精确检测线粒体内铜离子荧光探针的制备方法，其特征在于，所述荧光素衍生化合物和三苯基膦的摩尔比为1:1.2-2。4.根据权利要求2所述的通过光调控精确检测线粒体内铜离子荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的荧光素衍生物的制备方法如下：(1)将荧光素溶解在甲醇中，滴加的水合肼，回流8-14小时，除去溶剂，经硅胶柱层析提纯得到荧光素酰肼；(2)将荧光素酰肼和2-硝基苄溴...

【专利技术属性】
技术研发人员：李林，黄维，王刘林，陈步祥，张承武，刘金华，胡明宇，赵燕菲，彭平平，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32