可完全去疤的可逆末端终止功能核苷酸及其应用制造技术

本发明专利技术提供可完全去疤的可逆末端终止功能核苷酸及其应用。此功能核苷酸由含有C‑C糖苷键的核苷酸、连接核苷酸的碱基与荧光基团的邻二醇基可切割连接臂、荧光基团三部分构成。其中连接臂可被完全切除(可完全去疤)，并且连接臂较短。本发明专利技术连接臂的上述优点，有助于实现此可逆末端终止功能核苷酸在引物上高效合成延伸和有效终止，进而实现可逆末端终止测序的长读长。

Reversible end terminated functional nucleotides capable of completely removing scars and uses thereof

The present invention provides reversible terminator terminated functional nucleotides and their use. This function by nucleotide bases and fluorophore based diol nucleotides, containing C C glycosidic bond connecting nucleotide cutting connecting arm, fluorescent group is composed of three parts. The connecting arms can be completely removed (completely scarred) and the connecting arms are short. The advantages of the connecting arm of the present invention are helpful to realize the reversible end termination function, the nucleotide is efficiently synthesized, extended and effectively terminated on the primer, thereby achieving a long reading length of reversible end termination sequencing.

【技术实现步骤摘要】
可完全去疤的可逆末端终止功能核苷酸及其应用
本专利技术属于生物学
，特别涉及一种可完全除疤的可逆末端终止功能核苷酸及其在高通量测序技术上的应用。其中可逆末端终止功能核苷酸的连接臂可以经过两步反应而被完全去除(可完全去疤)，从而实现此可逆末端终止功能核苷酸在引物上高效合成延伸和有效终止，进而实现可逆末端终止测序的长读长。
技术介绍
上个世纪七十年代，由Sanger等专利技术的双脱氧链终止法第一代DNA测序技术，为科学发展做出了重大贡献，成就了“人类基因组计划”。但由于其通量低、成本高等的缺点，所以无法满足多物种大规模基因组测序以及深度和重复测序的需求，于是第二代高通量测序技术应运而生。从2005年至今，二代测序技术发展十分迅猛，各二代测序平台的更新换代速度之快令人目不暇接，其所产生的数据量也呈指数级增长，这极大地推动了几乎所有生物医学领域的研究进展。目前主流二代高通量测序仪所采用的二代测序技术主要有“合成测序法”和“连接测序法”两种。“可逆末端终止测序法”属于合成测序法(SequencingBySynthesis,SBS)的一种，由美国哥伦比亚大学的JingyueJu教授在2003年首先提出并付诸实践，是目前市场占有率最高、应用前景最被看好的一种二代高通量测序技术(LiZ,BaiX,RuparelH,etal.ProcNatlAcadSciUSA.2003,100:414-9.)。可逆末端终止法测序反应底物分子是一种具有可逆末端终止功能的核苷酸类似物，称为“可逆末端终止功能核苷酸”(reversibleterminator)。与传统Sanger测序法所采用的“双脱氧末端终止功能核苷酸”的最大不同在于，其末端终止基团的引物延伸终止功能是可逆的，可以通过一定的化学转变恢复为正常的、可以再次进行引物延伸的基团。目前，可逆末端终止功能核苷酸大体可分为两种：(a)第一种在核苷酸戊糖3’端羟基氧上连一个行使可逆末端终止功能的封闭基团。在这种情况下，与碱基上相连的可被切掉的荧光基团仅起到测序指示剂的作用(GuoJ,YuL,TurroNJ,JuJ.AccChemRes.2010,43(4),551-63.)。(b)第二种可逆末端终止封闭基团不位于3’端，而连接于碱基上。与碱基相连的荧光基团通常不仅起到测序指示剂的作用，而且也是可逆终止基团的一部分，起到了终止引物延伸的作用(BowersJ,MitchellJ,BeerE,etal.NatMethods.2009,6(8),593-5.)。这两种可逆末端终止功能核苷酸各有优劣，第一种由于有专门的可逆末端终止基团，可逆终止的效果可能会更好一点。第二种由于3’端没有修饰基团，更容易合成也更容易被DNA聚合酶所接受。3’末端带有封闭基团的可逆末端终止功能核苷酸目前发展比较成熟并已经商品化的有三种：(1)IlluminaSolexa所使用的3’-O-N3可逆末端终止功能核苷酸(BentleyDR,BalasubramanianS,SwerdlowHP,etal.Nature.2008,456(7218),53-9.)。(2)StevenABenner团队研发的3’-ONH2可逆末端终止功能核苷酸(HutterD,KimMJ,KaralkarN.,etal.Nucleos.Nucleot.Nucl.Acids,2010,29,879-895.)。(3)哥伦比亚大学JingyueJu团队研发的3’-O-丙烯基可逆末端终止功能核苷酸(GuoJ,YuL,TurroNJ,JuJ.AccChemRes.2010,43(4),551-63.)。单就可逆末端终止功能而言，这三种测序试剂的表现都是不错的，其可逆末端终止基团和荧光基团都可以几乎100％地被切除。对于可逆末端终止封闭基团连接于碱基上的可逆末端终止功能核苷酸，目前已商品化的只有Helicos公司的单分子测序仪所采用的'virtualterminator'。由于可逆末端终止功能核苷酸采用荧光作为测序指示剂，这极大地增强了测序的灵敏性与准确率，同时降低了上样量；并且由于采用了可逆末端终止测序策略，有效地解决了多聚重复序列(例如PolyA)的准确读取问题。这种测序策略可以准确读出大于18个连续的A。Solexa公司正是充分利用和发挥了可逆末端终止测序法的这些优势(并整合了原Illumina在DNA芯片上的优势)，在被Illumina购买后不到5年的时间内，迅速地在二代高通量测序市场上脱颖而出，成为了目前市场上应用最广泛的二代高通量测序仪。其在测序成本和测序通量上都击败了其主要竞争对手LifeTech公司ion系列测序平台，但其在读长上的优势并不明显(ChenF,DongM,GeM,etal.GenomicsProteomicsBioinformatics.2013,11(1),34-40)。影响可逆末端终止测序法读长的原因就在于：每一步切除荧光基团后在碱基上留下的连接臂残余(即疤痕)。每读出一个碱基，在延伸的引物上就加上一个带有疤痕的脱氧核苷酸。并且，随着测序引物的合成延伸，这种带有疤痕的脱氧核苷酸越积越多，这会极大地破坏DNA双螺旋结构的稳定性，从而影响DNA聚合酶与底物的结合；另一方面，这种带有疤痕的脱氧核苷酸也会影响DNA聚合酶对底物的识别。
技术实现思路
为了解决至少部分上述技术问题，本专利技术的专利技术人进行了深入研究，并发现通过由含有C-C糖苷键的核苷酸、连接核苷酸的碱基与荧光基团的邻二醇基可切割连接臂和荧光基团三部分构成的可逆末端终止功能核苷酸可完全去除连接臂残余。基于此完成了本专利技术。具体地，本专利技术包括以下内容。本专利技术的一方面，提供可完全去疤的可逆末端终止功能核苷酸，此功能核苷酸由含有C-C糖苷键的核苷酸、连接核苷酸的碱基与荧光基团的邻二醇基可切割连接臂和荧光基团三部分构成。在某些实施方案中，含有C-C糖苷键的核苷酸中的核苷酸为选自由dATP、dTTP、dGTP和dCTP组成的组中的至少之一。在某些实施方案中，邻二醇基可切割连接臂具有如下所述的结构式：-(CH2)m(CHOH)2(CH2)n-其中m和n分别为1至5的整数，例如，1、2、3、4或5。在某些实施方案中，荧光基团选自由Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、FITC、Alexa488、Alexa568、JOE、ROX、罗丹明6G(Rhodamine6G)、四甲基罗丹明(Tetramethylrhodamine)、丽丝胺(Lissamine)、德克萨斯红(TexasRed)、BODIPY576/589、BODIPY630/650和BODIPY650/665组成的组的至少之一。在优选的实施方式中，本专利技术的可逆末端终止功能核苷酸具有下式1所示的化学结构式之一。本专利技术的另一方面，提供可完全去疤的可逆末端终止功能核苷酸在高通量测序技术上的应用。在某些实施方案中，可完全去疤的可逆末端终止功能核苷酸在高通量测序技术上的应用包括下述具体步骤：1)测序DNA模板及引物的固定；2)引物延伸：向反应体系加入延伸反应混合液开始进行引物聚合延伸，此混合液主要包括DNA聚合酶(或逆转录酶)及四种不同碱基带有不同颜色荧光的可完全去疤可逆末端终止功能核苷酸；3)延伸终止：去离子水洗涤，清除延伸反应混合液本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可完全去疤的可逆末端终止功能核苷酸，其由含有C‑C糖苷键的核苷酸、连接碱基与荧光基团的邻二醇基可切割连接臂和荧光基团三部分构成。

【技术特征摘要】
1.一种可完全去疤的可逆末端终止功能核苷酸，其由含有C-C糖苷键的核苷酸、连接碱基与荧光基团的邻二醇基可切割连接臂和荧光基团三部分构成。2.根据权利要求1所述的可完全去疤的可逆末端终止功能核苷酸，其中所述含有C-C糖苷键的核苷酸中的核苷酸为选自由dATP、dTTP、dGTP和dCTP组成的组中的至少之一。3.根据权利要求1或2所述的可完全去疤的可逆末端终止功能核苷酸，其中所述邻二醇基可切割连接臂具有如下所述的结构式：-(CH2)m(CHOH)2(CH2)n-其中m和n分别为1至5的整数。4.根据权利要求1或2所述的可完全去疤的可逆末端终止功能核苷酸，其中所述邻二醇基可切割连接臂与所述荧光基团通过下述基团之一进行连接：NH-CO、CO-NH、CO-NH-NH、NH-NH-CO、NH-CO-NH或CO-NH-NH-CO。5.根据权利要求1或2所述的可完全去疤的可逆末端终止功能核苷酸，其中所述荧光基团选自由Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、F...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈非，张聚，马灌楠，贾鑫淼，董梦醒，
申请(专利权)人：中国科学院北京基因组研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11