本申请公开了一种使用碳二亚胺缩合化学法进行糖－蛋白缀合反应的改进方法。根据所涉及的糖或蛋白载体的性质，可通过向反应混合物中缓慢加入其中一种反应组分，改善所得缀合物的品质。本申请还提供免疫原性组合物，其中包含通过所公开的方法制备的糖－蛋白缀合物。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及进行碳二亚胺缩合反应的改进方法。具体地说，本发 明涉及使用碳二亚胺缩合进行的糖和蛋白的缀合。本专利技术还涉及含本 专利技术的糖-蛋白缀合物的可制备免疫原性组合物。在免疫学中将细菌荚膜多糖广泛用于预防细菌疾病已有多年。但是，此应用的问题在于免疫应答的T非依赖性特性。因此，这些抗原 在低龄儿童中的免疫原性差。此问题已通过将多糖抗原缀合至蛋白载 体(T辅助表位源)得以克服，然后可使用该载体激发T依赖性免疫应 答，甚至在生命的第一年中也可以。本领域已知多种缀合4支术。可通过如在US 4365170 (Jennings)和 US 4673574 (Anderson)中所记载的直接还原性胺化法制备缀合物。其 它方法描述于EP-0-161-188、 EP-208375和EP-0-477508。或者，缀合 法可借助1 -氰基-4-二甲氨基吡啶镜四氟硼酸盐(CD AP)对糖的羟基的 活化而生成氰酸酯。活化的糖由此可直接或经间隔(连接)基偶联至载 体蛋白上的氨基。例如，氰酸酯可与己二胺或己二酸二酰肼(ADH或 AH)偶联，并使用碳二亚胺(例如EDAC或EDC)化学法经蛋白载体上 的羧基将氨基衍生化的糖缀合至载体蛋白上。这类缀合物描述于PCT 公布申请WO 93/15760 Uniformed Services University以及WO 95/08348和WO 96/29094。另参见Chu C.等，Infect. Immunity, 1983 245 256。一般来说，蛋白载体上以下类型的化学基团可用于偶联/缀合A) 羧基(例如经天冬氨酸或谷氨酸)，可使用碳二亚胺化学法将其 与糖部分上的天然或衍生化氨基缀合；B) 氨基(例如经赖氨酸)，可使用碳二亚胺化学法将其与糖部分上 的天然或衍生化羧基缀合；C) 巯基(例如经半胱氨酸)；D) 羟基(例如经酪氨酸)；E) 咪唑基(例如经组氨酸)；F) 胍基(例如经精氨酸)；和G) 吲哚基(例如经色氨酸)。在糖上， 一般来说以下基团可用于偶联OH、 COOH或NH2。 醛基可在本领域已知的不同处理(例如高^ 典酸盐、加酸水解、过氧化 氢等)之后产生。直接偶联法糖-OH + CNBr或CDAP —氰酸酯+雨2-蛋白质—缀合物 糖-醛+ NHr蛋白质—席夫碱(Schiff base) + NaCNBH3 —缀合物 糖-COOH +雨2-蛋白质+ EDAC —缀合物 糖-丽2 + COOH-蛋白质+ EDAC —缀合物经间隔基(连接物)法直接偶联糖-OH + CNBr或CDAP ~>氰酸酯+ NH2——NH2 —糖——丽2 + COOH-蛋白质+ EDAC —缀合物糖-OH + CNBr或CDAP —氰酸酯+ NH2——SH—糖——SH + SH-蛋 白质(具有暴露的半胱氨酸的天然蛋白或在例如通过SPDP修饰蛋白 的氨基后获得的天然蛋白)—糖-S-S-蛋白质糖-OH + CNBr或CDAP —氰酸酯+ NH2——SH —糖——SH +马来 酰亚胺-蛋白质(氨基修饰)~>缀合物糖-COOH + EDAC + NH2——NH2 —糖-顺2 + EDAC + COOH-蛋白 质—缀合物糖-COOH + EDAC + NH2——SH —糖-SH + SH-蛋白质(具有暴露的 半胱氨酸的天然蛋白或在例如通过SPDP修饰蛋白的氨基后获得的天 然蛋白)—糖-S-S-蛋白质糖-COOH + EDAC + NH2——SH —糖——SH +马来酰亚胺-蛋白质 (氨基修饰)-缀合物糖-醛+ NH2——NH2 —糖——NH2 + EDAC + COOH-蛋白质—缀合物可以观察到，碳二亚胺化学法(例如使用EDAC)对于缀合反应是 非常便利的，因为其利用了糖和/或蛋白上的基团，这些基团可天然存 在，或者可容易地通过衍生化插入。还通过肽键便利地连接各部分。碳二亚胺(RNONR')是具有丙二烯结构的不饱和化合物 (Nakajima和Ikada 1995 Bioconjugate Chem. 6:123-130; Hoare和 Koshland 1967 JBC 242:2447-2453)。该化学物质在其反应pH (4.5-6.5) 相对不稳定，因此在本领域倾向于将糖/蛋白/碳二亚胺缀合反应的所 有组分一起加入。本专利技术人已发现，根据要缀合的糖和蛋白的性质，通过将反应的 某些组分緩慢加入混合物中可获得对疫苗应用较好的最终缀合物特 性。这样做可实现一种或多种利益/改善，例如缀合物中的糖产量、 缀合物的可除菌过滤性、缀合更好控制、更容易重现和/或防止部分内 部交联。因此，在一个实施方案中，提供一种使用碳二亚胺缩合化学法将 糖与蛋白载体缀合的方法，其中糖包含(例如作为其重复单元的一部分) 或经衍生化后包含氨基和/或羧基，其中蛋白载体包含或经衍生化后包 含氨基和/或羧基，所述方法包括以下步骤I) 如果蛋白载体同时包含氨基和羧基，而糖包含氨基和羧基之中 的任一个，贝'J:a) 将糖和进行缀合所需的等份碳二亚胺混合，和b) 在35秒至6小时的时间段内加入所需的等份蛋白载体；II) 如果糖同时包含氨基和羧基，而蛋白载体包含氨基和羧基之 中的任一个，贝寸a)将蛋白载体和进行缀合所需的等份碳二亚胺混合，和b)在35秒至6小时的时间段内加入所需的等份糖； III)如果糖同时包含氨基和羧基，而且蛋白载体也同时包含氨基 和羧基，贝'J:a) 将蛋白载体和糖混合，和b) 在35秒至6小时的时间段内加入进行缀合所需的等份碳二亚胺。专利技术详述可使用任意合适的碳二亚胺，只要其能够在水性介质中缀合糖和 蛋白。在一个实施方案中，碳二亚胺可为EDAC(l-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亚胺)，或者可为非EDAC的碳二亚胺。术语"糖"在本说明书全文中可指多糖或寡糖，并包括这二者。 糖可指脂多糖(LPS)或脂寡糖(LOS)。在使用之前，多糖(例如细菌多糖) 可从来源菌林(例如细菌)分离出来，或者从来源菌林分离出来后通过 已知方法(参见例如EP497524和EP497525; Shousun Chen Szu等-Carbohydrate Research第152巻，第7-20页(1986))如微流化法分级至 某种程度。多糖可依大小分级，以便降低多糖样品的粘度和/或改善缀 合产物的过滤性。寡糖的重复单元较少(典型地为5-30个重复单元)， 典型地为水解多糖。术语"蛋白载体"意欲涵盖小肽和大的多肽("OkDa)这二者。显 然，大的多肽更有可能同时包含无任何修饰的活性氨基和羧基。就本专利技术而言，"天然"多糖是指还未经处理的糖，因为处理的 目的是降低糖的大小。在正常纯化程序中可使多糖的大小略微降低。 这样的糖仍是天然的。只有在多糖已经历分级技术的情况下，多糖才 不被看作是天然的。就本专利技术而言，"以最多x2的因数分级"是指糖经过处理，预 期糖的大小下降，但将大小保持在天然多糖大小的一半以上。x3、 x 4等以相同方式解释，即糖经过处理，预期多糖的大小下降，但将大小保持在天然多糖大小的1/3、 1/4等以上。在上述方法的步骤b)中，用于加入所有等份的终组分的35秒至 6小时时间_艮可为50秒至5小时、1分钟至4小时、2分钟至3小时、 3分钟至2本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种使用碳二亚胺缩合化学法将糖与蛋白载体缀合的方法，其中所述糖包含（例如作为其重复单元的一部分）或经衍生化后包含氨基和／或羧基，其中所述蛋白载体包含或经衍生化后包含氨基和／或羧基，所述方法包括以下步骤： Ⅰ）如果所述蛋白载体同时包含氨基和羧基，而所述糖包含氨基和羧基之中的任一个，则： ａ）将糖和进行缀合所需的等份碳二亚胺混合，和 ｂ）在３５秒至６小时的时间段内加入所需的等份蛋白载体； Ⅱ）如果所述糖同时包含氨基和羧基，而所述蛋白载体包含氨基和羧基之中的任一个，则： ａ）将蛋白载体和进行缀合所需的等份碳二亚胺混合，和 ｂ）在３５秒至６小时的时间段内加入所需的等份糖； Ⅲ）如果所述糖同时包含氨基和羧基，而且所述蛋白载体也同时包含氨基和羧基，则： ａ）将蛋白载体和糖混合，和 ｂ）在３５秒至６小时的时间段内加入进行缀合所需的等份碳二亚胺。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：RL比曼斯，P迪维维耶，
申请(专利权)人：葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司，
类型：发明
国别省市：BE[比利时]
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