成熟自然杀伤细胞的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种诱导前驱自然杀伤细胞分化为成熟自然杀伤细胞的Ａｘｌ受体酪氨酸激酶的配体。而且，本发明专利技术还涉及一种成熟自然杀伤细胞的制备方法，即，通过白细胞间介素－７、干细胞因子及Ｆｌｔ３配体处理造血母细胞，由此将其分化为前驱自然杀伤细胞，并在Ａｘｌ受体酪氨酸激酶的配体的处理下，使前驱自然杀伤细胞分化为成熟自然杀伤细胞的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种诱导前驱自然杀伤细胞(Natural killer cell，NK)分 化为成熟自然杀伤细胞的Axl受体酪氨酸(tyrosine)激酶(kinase) 的配体。本专利技术还涉及一种，其为利用白细 胞间介素-7 ( interleukin-7)、干细胞因子(SCF )及Flt3配体处理造 血母细胞，使之分化为前驱自然杀伤细胞后，再利用Axl受体酪氨酸激酶 的配体处理前驱自然杀伤细胞，使之分化为成熟自然杀伤细胞。
技术介绍
本专利技术涉及一种诱导前驱自然杀伤细胞(precusor natural killer cell, pNK)分化为成熟自然杀伤细月包(mature natural killer cell, mNK) 的Axl受体酪氨酸激酶(Axl Rec印tor tyrosine kinase,以下简称"Axl") 的配体。尤其涉及一种，其为利用白细胞间 介素-7、干细胞因子及Flt3配体(类似于Fms的酪氨酸激酶3配体)处理造 血母纟田月包，^f吏之分^f匕为前马区自然杀伤纟田月包(precursor Natural killer cell, pNK)后，再利用Axl的配体处理前驱自然杀伤细胞，使之分化为成 熟自然杀伤细胞。当前的治癌疗法——外科手术法、药物疗法、放疗法等虽有暂时的疗 效，但同时还存在耐受性、复发或引发各种副作用的问题。因此，为了开 发抗癌剂和诊断试剂，发达国家正在蓬勃发展能够调节免疫反应的免疫治 疗法的开发研究，但能够有效地进行对癌的诊断、预防及治疗的免疫细胞 治疗法的开发尚处于初级阶段。据报道，自然杀伤细胞(Natural Killer cell, NK)干预消灭病原菌、癌细胞、同种异基因细胞(allogeneic cell) 等的自然免疫(innate immunity)活动中，其分泌干扰素-Y (interferon gamma ; IFNg )、肿瘤坏死因子-a (TNF-a )、白细胞间介素-12等细胞 分裂素(cytokine),介导适应性免疫(adapt ive immunity)， 由jt匕只于癌J!r有特异性记忆形成调节能力，但对各种不同的癌，自然杀伤细胞的功能及 分化能力有缺陷。已知利用自然杀伤细胞的治癌疗法有，通过白细胞间介素-2活化自然杀伤细胞，以此增加对癌细胞的免疫反应的方法，但这种方 法不仅引发副作用，而且每个人对疗效的持续性、耐受性及效果等诸多方 面上有所区别。为了提高自然杀伤细胞的杀癌效果，最重要的是要大量确保高活性自然杀伤细胞。自然杀伤细胞可应用于治疗癌症或难治性病毒感染等疾病，在 实际临床上需要100亿个以上自然杀伤细胞。但自然杀伤细胞很难增殖， 迄今为止试图用各种方法解决这一问题，但利用白细胞间介素-2或白细胞 间介素-15最多只能增殖数十倍，但后来经研究表明，如果混合他人的癌细胞，就能增殖数百倍。2005年发表的最新增殖方法表明，如果共同培养混 合有两个遗传基因的他人癌细胞，就能增殖1000倍，但这一方法尚处于研 究开发阶段。但要使增殖量至少达到数百倍以上，起码要和他人的癌细胞 进行共同培养。不过，和他人的癌细胞共同培养或者使用他人的遗传基因， 尚存在安全及伦理问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，通过诱导前驱自然杀伤细胞分化为成熟自然杀伤 细胞，提供大量的成熟自然杀伤细胞。本专利技术的另一目的在于，提供一种诱导前驱自然杀伤细胞分化为成熟 自然杀伤细胞的物质。本专利技术的另一目的在于，利用少量的白细胞间介素-2处理成熟自然杀 伤细胞，以提供活性化成熟自然杀伤细胞。本专利技术的再一个目的在于，提供一种包含通过本专利技术的方法分化并活 性化的成熟自然杀伤细胞的免疫细胞治疗剂。的方法，研究了由造血母细胞分化为成熟自然杀伤细胞的过程(图1)，结 果发现了分化促进基因Axl。 Axl (pl40)是属于Sky、 Eyk科(f ami ly)的酪 氨酸受体磷酸化酶，Axl科中包含Rse (Sky, Brt， Tif， Dtk, Tyro3) 、Mer (Eyk, Nyk， Tyro12),而现有的研究表明在大部分组织上表达Axl、 Rse和Mer， 但尚没有对其功能的报道。已知Axl的配体有Gas6,这是维生素K依赖性 纟田月包生长因子(vitamin K—dependent growth—potent iating factor),才居 推测，从Axl独特的结构来看，其干预细胞的移动、生长、分化。据报 道，Axl虽然可以表达在纤维原细胞(fibroblast )、骨髓祖细月包(myeloid progenitor)、巨p藍细胞、神经组织、卵胞、骨骼肌(skeletal muscle) 等，但不会在淋巴细胞(lymphocyte)上表达。虽然Axl和Gas6起到对 抗原提示细胞的自身稳定性(Homeostasis)及造血母细胞成长的调节作 用，但尚没有研究结果表明Axl和Gas6可调节自然杀伤细胞的产生及功能。 本专利技术的专利技术人经过研究发现，在前驱自然杀伤细胞分化为成熟自然杀伤 细胞的过程中，Axl将起到必不可少的作用，并基于Axl对自然杀伤细胞的 分化调节剂作用，确立了从老鼠骨髓中提取造血母细胞，并利用Axl抗体 及/或Gas6,使造血母细胞分化为成熟自然杀伤细胞的系统。之后，经改良及变更这种分化系统后，将其适用于由人体末梢血液、骨髓或脐带血提取 的造血母细胞，由此成功地生产了功能强化的大量成熟自然杀伤细胞。基于上述成功研究，本专利技术一方面提供一种诱导造血母细胞分化为成 熟自然杀伤细胞的Axl的配体。本申请中所谓"配体"是指，和Axl受体相结合，以使该受体产生功能性反应的多肽或化合物。本专利技术的配体包含Axl 抗体、Gas6及蛋白质S(protein S)。所谓"分化" 一般指，较单纯的一 个系分成两个以上不同本质的部分系的现象。即，指结构及功能特殊化的 现象。成熟自然杀伤细胞中所谓"成熟"是指，自然杀伤细胞具有能够发 挥细胞固有功能的能力，例如具备认知癌细胞，并直接杀死癌细胞的能力。 自然杀伤细胞是否成熟，可通过将表达物质作为标记来得到确认，而对老 鼠和人来说，本领域技术人员已很清楚地了解这些标记。例如，老鼠的标 记(marker )有NK1. 1、 CD122、 LY49族(Ly49A、 Ly49C、 Ly49D、 Ly49E、 Ly49F、 Ly49G、 Ly49H、 Ly491) 、 NKG2A/C/E等，人体的标记有NKG2A、 NKG2D、 NKp30、 NKp44、 NKp46、 CD56、 CD161。另一方面，本专利技术提供一种，该方法包 括以下步骤i、 利用白细胞间介素-7、干细胞因子及FU3配体处理造血母细胞， 使之分化为前驱自然杀伤细胞；ii、 利用Axl的配体处理前驱自然杀伤细胞，使之分化为成熟自然杀 伤细胞，由此获得成熟自然杀伤细胞。做为另一种形态，本专利技术还提供人体， 其特征在于，所述造血母细胞源于人体骨髓、末梢血液或脐带血中一种。其特征在于，所述Axl的配体选自;Axl蛋白质的:体:Y-羧化Gas6蛋 白质、或者两者的配合物。做为另一种形态，本专利技术所提供的人体， 其特征在于，在与人体基质细胞共同培养条件下，用配体处理前驱自然杀 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种Ａｘｌ的配体，其诱导前驱自然杀伤细胞分化为成熟自然杀伤细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜馨植，金相泫，金银美，李恩姬，尹精，高昌甫，许荣真，沈佑永，许成范，尹智然，
申请(专利权)人：全南大学校产学协力团，株式会社顾系莱佛，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]