突变的TIMP-3制造技术

一种突变的ＴＩＭＰ－３（金属蛋白酶－３的组织抑制剂）多肽，其中另外的一个或多个残基，例如丙氨酸残基，位于ＴＩＭＰ－３多肽的Ｎ－末端残基之前；或其中对应于ＴＩＭＰ－３的苏氨酸２的残基突变为甘氨酸。据认为，这样的突变体保留作为ＡＤＡＭ（如ＴＡＣＥ，ＡＤＡＭＴＳ－４和ＡＤＡＭＴＳ－５）的抑制剂的活性，但是具有减弱的作为ＭＭＰ抑制剂的活性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】突变的TIMP-3本专利技术涉及解联蛋白-金属蛋白酶(ADAM)的抑制剂，特别是 ADAM 17/TACE (tumor necrosis factor a-converting enzyme ，月中瘤*不死因子a-转化酶)和聚蛋白多糖酶(aggrecanase )的抑制剂，具体而言涉及ADAMTS-4 和ADAMTS-5的抑制剂。Zn-内肽酶的两个家族，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP1) 和解联蛋白-金属蛋白酶(ADAM)催化细胞外基质(ECM)和细胞表面上的重 要的蛋白水解反应。主要由MMP催化的基质中的蛋白质的循环是形态发 生、组织重塑、胚泡移植、伤口愈合和许多其他重要的生理过程所需要的(l)， 而ADAM催化细胞表面蛋白质的胞外结构域的脱落，释放细胞因子、生长 因子、细胞粘附分子和受体(2, 3),与信号传导相关的过程，细胞生长，细 胞-细胞和细胞-基质相互作用。特异性的MMP和ADAM的增加的活性是 许多重要的人疾病的基础或对此有促进作用，所述疾病包括癌症、类风湿 性关节炎、骨关节炎和心脏病(l-3)。细胞外基质中的MMP活性由四种内源抑制性蛋白质调节金属蛋白酶 的组织抑制剂(tissue inhibitors of metallo-proteinase， TIMP)-1到-4。这些是， 极少例外地，在人中发现的超过20种MMP的广谱抑制剂(4)。此外，TIMP-3 有效抑制一些蛇毒蛋白酶，包括ADAM10(5) 、 ADAM12-S(6)、 ADAM17/TACE (肿瘤坏死因子ot-转化酶；(7))和某些具有血小板反应蛋白基 序的ADAM，如ADAMTS-4和ADAMTS-5 (8); TIMP-l也抑制ADAM-10(5)。TIMP具有两个结构域，并且显示多种生物活性，如刺激某些细胞的生 长，诱导或保护免于凋亡，和抑制血管发生(9, 10)。所述金属蛋白酶抑制活 性位于较大的(~120-残基)N-末端结构域中，而较小的 65-残基的C-末端结 构域介导与一些原-MMP的血红素结合蛋白结构域的相互作用。导致X到 Cys取代的人TIMP-3基因中的突变和在人TIMP-3的C-末端结构域中的截 短是索斯比眼底营养不良(Sorsbys ftmdus dystrophy )的原因，该疾病是一 种常染色体显性疾病，其产生早期发作的黄斑变性(ll, 12)。TIMP-1与MMP-3的催化结构域的复合物(13)，以及TIMP-2与膜类型 MMP,MMP-14(MT1-MMP;(14))的复合物的结构，这些结构显示在TIMP 的保守Cys'到Cys7G 二减/建(TIMP-l序列编号)周围的结构上相邻的区域插 入MMP的活性位点沟槽。Cys1通过其氨基和羰基两齿地调整催化性Zn2+， 而残基2(Thr或Ser)的侧链进入蛋白酶的Sl，特异性口袋的入口。大多数与 MMP的相互作用(75%)涉及在Cys1到Cys^二硫键周围的TIMP的多肽链的 两个部分(残基1-4和66-70，见图1)。通过氨曱酰化(15)或乙酰化作用(16) 封闭N-末端-氨基基团，以及另外加入额外的残基(16， 17)，使TIMP的MMP 抑制性活性失活。单一和组合取代在相互作用表面的关键氨基酸，残基2，4 或68，不同程度地影响N-TIMP-1对不同MMP的亲和性(18， 19)。这显示， TIMP的特异性可以被修饰，以产生耙向性更强的MMP抑制剂。TACE(ADAM-17)是1型膜蛋白质，由细胞外多结构域区域、跨膜部分 和C-末端细胞质结构域组成。在活性酶的细胞外区域中包含金属内肽酶催 化结构域、解联蛋白结构域、富含半胱氨酸的结构域和花菜蛋白样结构域(2, 3)。先前许多关于TACE的结构特性、催化特性和抑制特性的研究集中于截 短的催化结构域(20-24)，但是一些研究显示细胞外区域的非催化结构域对 酶促特性如底物识别和酶原激活具有明显的影响(25, 26)。一些ADAM缺乏蛋白酶活性，但是具有催化活性的那些与MMP都有 规则的结合Zn的HExxHxxGxxH序列基序和在他们的催化结构域中的Met-4争角(http:〃www.people.virginia.edu/ iw7g/)。 然而，ADAM和MMP在总的 序列上非常多样，并且其催化结构域在三维结构中相当不同(20)。我们提供作为ADAM (例如TACE, ADAMTS-4， ADAMTS-5以及 ADAM10和ADAM12-S )的抑制剂的N-TIMP-3的突变体，但是其中与MMP 相互作用的界面被破坏。这些作为ADAM (如TACE和ADAMTS-4和 ADAMTS-5 )的抑制剂的突变体的特性提示TIMP-3与ADAM (如TACE 和ADAMTS-4和ADAMTS-5 )的相互作用和抑制机制与和MMP的那些是 不同的，并且还说明这些突变体可作为ADAM (如TACE和ADAMTS-4和 ADAMTS-5)的选择性抑制剂。这些突变体也是产生ADAM (如TACE, ADAMTS-4和ADAMTS-5 )的另外的选择性抑制剂中有用的前导化合物。本专利技术的第一方面提供突变的TIMP-3 (金属蛋白酶-3的组织抑制剂) 多月太,其中另外的残基，或1到2，3，4，5，6，8，10, 12，15，18或20个残基，位于紧挨着成熟TIMP-3多肽的第一氨基酸残基(Cysl)的氨基末端一侧，或 者，其中对应于TIMP-3的苏氨酸2的残基突变为甘氨酸或下面的L-氨基酸 中的 一种Ala, Cys， Asp， Glu, Phe， His, lie, Lys， Asn， Pro, Gln， Arg， Val, Trp。这些突变的TIMP-3多肽被认为抑制ADAM (例如TACE, ADAMTS-4 或ADAMTS-5 )，但是与野生型TIMP-3或N-TIMP-3相比，对MMP (例 如MMP-l， MMP-2,基质降解酶1的催化结构域(MMP-3 (AC))或1型膜 MMP(MMP-14))的抑制要弱得多(例如，弱l， 2或3个数量级)。另外的一个或多个残基(例如，两个，三个，四个或更多(多到20个) 氨基酸残基)位于紧邻半胱氨酸1的N-末端侧，所述半胱氨酸1是成熟活 性形式的TIMP3的第一个氨基酸。在TIMP-3多肽的N-末端残基的氨基末 端一侧的这一另外的氨基酸残基(或另外的一个或多个残基)可以是例如 L-丙氨酸残基或可能是其他19个在蛋白质中天然存在的氨基酸中的任何一 个，例如Gly，或下列L-氨基酸中的任何一个Asp, Cys, Glu， Phe, His, lie, Lys， Leu， Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser， Thr, Val, Trp, Tyr。如在实施例中所讨论，具有两个位于紧邻半胱氨酸1的N-末端侧的氨 基酸残基的突变的TIMP-3多肽的实例是(-2A)N-TIMP-3突变体，其被认为 对ADAMTS-5比对N-TIMP-3更具选择性，所述半胱氨酸1是成熟活性形 式的TIMP-3的第一个氨基酸。N-末端的氨甲酰化或乙酰化作用还可以提供TIMP-3多肽，其抑制 ADAM(如TAC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种突变的ＴＩＭＰ－３（金属蛋白酶－３的组织抑制剂）多肽，其中额外的残基，或１到２，３，４，５，６，８，１０，１２，１５，１８或２０个残基，位于紧挨着成熟ＴＩＭＰ－３多肽的第一个氨基酸残基（Ｃｙｓ１）的氨基末端侧；或其中对应于ＴＩＭＰ－３的苏氨酸２的残基突变为甘氨酸，或突变为下列Ｌ－氨基酸中任一种：Ａｌａ，Ｃｙｓ，Ａｓｐ，Ｇｌｕ，Ｐｈｅ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｙｓ，Ａｓｎ，Ｐｒｏ，Ｇｌｎ，Ａｒｇ，Ｖａｌ，Ｔｒｐ。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：长濑英明，基思布鲁，
申请(专利权)人：帝国改革有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]