一种氨基糖苷类药物通用人工抗原的合成方法技术

一种氨基糖苷类药物的通用人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。本发明专利技术以新霉胺为半抗原，用戊二醛法将其与载体蛋白ＢＳＡ偶联，用凝胶电泳法测定偶联物的偶联比。本发明专利技术成功合成了新霉胺的人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了必需的人工抗原，可以满足国内对氨基糖苷类药物研究的需要。

【技术实现步骤摘要】

，属于生物化工

技术介绍
新霉胺，英文名称Neamin， CAS号5144-52-5，分子式为C12H25N406，俗称新霉素A，是氨基糖苷类药物的结构共同体。氨基糖苷类药物是一类由氨基 糖分子和非糖部分的糖元结合而成的抗生素。该类抗生素应用广泛，是进行治 疗药物监测的广谱抗生素。其作用特点是能够与核糖体30S亚单位结合，导致 其合成异常蛋白，阻碍易合成蛋白的释放，从而抑制细菌的生长。临床上氨基 糖苷类抗生素主要用来治疗大肠杆菌引起的肠道感染、细菌性痢疾、皮肤粘膜 感染以及眼部感染等。但由于其使用方法不当或不遵守休药期规定等原因，均 可造成它在畜产品中的残留，给人类健康带来严重危害，如破坏胃肠道菌群平 衡和增强细菌耐药性等。现有的微生物检测法和仪器检测法很难实现对氨基糖 苷类抗生素进行快速、准确、多残留的检测。目前国内外尚未有理想的针对氨 基糖苷类药物多残留免疫检测方法的报道。为了弥补这一空白，设计了以氨基 糖苷类抗生素的结构共同体新霉胺为半抗原的合成氨基糖苷类药物免疫检测的 完全抗原。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供。所制 备的产品用于氨基糖苷类抗生素的免疫分析方法研究。为今后人们的研究提供 了必需的人工抗原。本专利技术的技术方案 一种氨基糖苷类药物的通用人工抗原的合成方法，以新霉胺为半抗原，用戊二醛法将其与载体蛋白牛血清白蛋白BSA偶联，用凝胶 电泳法测定偶联物的偶联比；(1)人工抗原的合成控制新霉胺、戊二醛、牛血清白蛋白以摩尔比为 150:35:1的比例反应，首先让半抗原新霉胺与牛血清白蛋白溶于0.1 mol/L碳酸 钠缓冲液室温混匀，逐滴加入现配的1%的戊二醛水溶液，温和搅拌反应15分 钟后，反应液中加入硼氢化钠至终浓度为10mg/mL，然后置4"C下温孵1.5小时， 即得人工抗原混合液；透析袋前处理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60'C的去离 子水冲洗3min，保存在4。C去离子水中备用；将人工抗原混合液移入透析袋中，用2X2L的0.01M的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液和2X2L的去离子水透析3天，最后使用冻干法将透析袋中的液体制成 粉末，即得到人工抗原7-新霉胺-牛血清蛋白；(2)人工抗原的鉴定人工抗原采用凝胶电泳法鉴定其偶联结果，利用标准蛋白得到标准曲线，计算其偶联比。偶联比测定是估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方 法，虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量 (或相对含量)的原理建立起来的。凝胶电泳法是依据合成的人工抗原的分子 量比载体蛋白的分子量增加来确定偶联比的。偶联物蛋白浓度测定配制浓度为0， 40， 60， 80， 100， 120， 160， 200吗'mL—1 的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，3(TC水浴 温热5分钟，每个浓度做平行样.在595nm处测吸光值，绘制牛血清蛋白浓度 与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定抗原溶液 的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。本专利技术的有益效果本专利技术成功合成了新霉胺的人工抗原，被用作一种氨 基糖苷类药物通用人工抗原，合成步骤简洁，有效，可完全用于免疫分析中， 为以后人们的研究提供了方便的途径，可以满足国内对氨基糖苷类药物研究的 需要。 附图说明图1低分子量标准蛋白Mark、牛血清蛋白BSA及其偶联物的凝胶电泳图。 A:低分子量标准蛋白Mark， B:新霉胺人工抗原，C:牛血清蛋白BSA。图2电泳标准曲线图(lgMW-Rf图)。 具体实施例方式实施例1(1) 人工抗原的制备15mg新霉胺、20mg牛血清蛋白BSA溶于lOmLO.l mol/L碳酸钠缓冲液(pH 7.3、含有0.15mol/LNaCl)，逐滴加入现配的质量浓度1%的戊二醛水溶液1.0 mL， 温和搅拌15分钟后，反应液中加入硼氢化钠至终浓度为10mg/mL，然后置4°C 下温孵1.5小时，即得人工抗原混合液。透析袋前处理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用6(TC的去离 子水冲洗3min，保存在4'C去离子水中备用。将人工抗原混合液移入透析袋中，用2X2L的0.01M的PBS溶液和2X2L 的去离子水透析3天。最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人 工抗原。(2) 新霉胺人工抗原的鉴定偶联比测定是估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法，虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量 (或相对含量)的原理建立起来的。凝胶电泳法是依据合成的人工抗原的分子量比载体蛋白的分子量增加来确定偶联比的。SDS-聚丙烯酰胺电泳利用迁移率 只与分子量有关，而与所带电荷、分子形状无关，可以利用SDS-聚丙烯酰胺电 泳来确定人工抗原的分子量从而确定偶联比。本实验采用10%的分离胶，5%的 压縮胶，对低分子量标准蛋白Mark、牛血清蛋白BSA、人工抗原进行SDS-聚 丙烯酰胺电泳，利用FR980生物电泳凝胶成像系统软件做出低分子量标准蛋白 lgMW-Rf图，并计算得到人工抗原的分子量从而确定偶联比为17，完全适合免 疫要求。偶联物蛋白浓度测定配制浓度为0， 40， 60， 80， 100， 120， 160， 200 (xg'mU1 的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30'C水浴 温热5分钟，每个浓度做平行样.在595nm处测吸光值，绘制牛血清蛋白浓度 与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定抗原溶液 的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。本实验计算得抗原溶液 的蛋白浓度为l.SSASmg'mlA权利要求1、一种氨基糖苷类药物的通用人工抗原的合成方法，其特征是以新霉胺为半抗原，用戊二醛法将其与载体蛋白牛血清白蛋白BSA偶联，用凝胶电泳法测定偶联物的偶联比；(1)人工抗原的合成控制新霉胺、戊二醛、牛血清白蛋白以摩尔比为150∶35∶1的比例反应，首先让半抗原新霉胺与牛血清白蛋白溶于0.1mol/L碳酸钠缓冲液室温混匀，逐滴加入现配的1％的戊二醛水溶液，温和搅拌反应15分钟后，反应液中加入硼氢化钠至终浓度为10mg/mL，然后置4℃下温孵1.5小时，即得人工抗原混合液；透析袋前处理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.01M的pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液和2×2L的去离子水透析3天，最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原7-新霉胺-牛血清蛋白；(2)人工抗原的鉴定人工抗原采用凝胶电泳法鉴定其偶联结果，利用标准蛋白得到标准曲线，计算其偶联比。全文摘要一种氨基糖苷类药物的通用人工抗原的合成方法，属于生物化工
本专利技术以新霉胺为半抗原，用戊二醛法将其与载体蛋白BSA偶联，用凝胶电泳法测定偶联物的偶联比。本专利技术成功合成了新霉胺的人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了必需的人工抗原，可以满足国内对氨基糖苷类药物研究的需要。文档编号C07K1/10GK101318989SQ2008101本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种氨基糖苷类药物的通用人工抗原的合成方法，其特征是以新霉胺为半抗原，用戊二醛法将其与载体蛋白牛血清白蛋白ＢＳＡ偶联，用凝胶电泳法测定偶联物的偶联比；（１）人工抗原的合成：控制新霉胺、戊二醛、牛血清白蛋白以摩尔比为１５０∶３５∶１的比例反应，首先让半抗原新霉胺与牛血清白蛋白溶于０．１ｍｏｌ／Ｌ碳酸钠缓冲液室温混匀，逐滴加入现配的１％的戊二醛水溶液，温和搅拌反应１５分钟后，反应液中加入硼氢化钠至终浓度为１０ｍｇ／ｍＬ，然后置４℃下温孵１．５小时，即得人工抗原混合液；透析袋前处理：取１０ｃｍ的透析袋，于沸水中煮沸５ｍｉｎ，再用６０℃的去离子水冲洗３ｍｉｎ，保存在４℃去离子水中备用；将人工抗原混合液移入透析袋中，用２×２Ｌ的０．０１Ｍ的ｐＨ７．４的磷酸盐缓冲溶液和２×２Ｌ的去离子水透析３天，最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原：７－新霉胺－牛血清蛋白；（２）人工抗原的鉴定：人工抗原采用凝胶电泳法鉴定其偶联结果，利用标准蛋白得到标准曲线，计算其偶联比。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胥传来，马伟，彭池方，徐丽广，李灼坤，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]