本发明专利技术公开了一种Ｎ端特异的人ＤＢＦ４Ｂ多肽及其抗体的制备方法，属于以抗体为特征的体外试验用的生物制品。Ｎ端特异的人ＤＢＦ４Ｂ多肽的氨基酸序列为：ＫＮＳＰＧＡＲＫＨＰＦＳＧＫＳ。抗人ＤＢＦ４Ｂ多肽抗体按以下方法制备：（１）人ＤＢＦ４Ｂ抗原表位的分析；（２）人ＤＢＦ４Ｂ Ｎ端多肽的合成；（３）合成多肽与载体蛋白交联；（４）制备兔抗人ＤＢＦ４Ｂ多肽抗体；（５）收集、分离得到含有抗体的血清，纯化抗体，即得到抗人ＤＢＦ４Ｂ多肽抗体。本发明专利技术制备的Ｎ端特异的抗人ＤＢＦ４Ｂ合成多肽抗体效价高、亲和力强、特异性好，可与天然人ＤＢＦ４Ｂ发生特异性结合反应；制备成本低；纯化后的抗体可完全用于免疫印迹和酶联免疫吸附实验，以及建立体外免疫分析方法。该抗体为ＤＢＦ４Ｂ在细胞周期和基因组复制中的生物学作用研究提供了有用的工具。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及以抗体为特征的体外试验用的生物制品，具体是一种N端 特异的人DBF4B多肽及其抗体制备方法，属于生物医学
技术介绍
DBF4B (DBF4homologBisoform2)是CDC-7类似蛋白1的调控因 子，它是一种参与细胞周期调控和基因组复制的丝氨酸一苏氨酸激酶。 DBF4B定位于细胞核，其表达受到细胞周期的调控。
技术实现思路
本专利技术是为解决通过免疫实验特异性检测人DBF4B的表达与天然存 在，并建立相应体外免疫分析所需基本生物制品的问题，而提供的一种能 特异性针对人DBF4B的N端的合成多肽、相应抗体及其制备方法。本发 明还可同时解决目前使用的类似抗体价格高，亲和力低，抗体结合蛋白的 位置不特异且抗原性较差等问题。本专利技术所述的抗人DBF4B合成多肽、 相应抗体，按照以下步骤制备抗原表位分析与拮抗位置确定利用多种表位预测软件，如DNAstar， OMIGA， UWGCG等进行综合分析，主要考量指标包括亲水性结构、抗 原指数、表面可及性等，再结合我们已有实际制备抗体的验证经验，最终 确定第38到第52位为该抗体的靶标，其氨基酸序列为 KNSPGARKHPFSGKS。多肽的合成靶标多肽采用全自动多通道多肽合成仪合成，柱层析纯化，然后通过HPLC，用每分钟1。/。的标准乙晴梯度来检测纯度。多肽与载体蛋白交联由于本合成多肽分子量太小，在动物体内不能 诱导产生免疫反应，因此将多肽与载体蛋白交联后才能进行免疫，选择钥 孔嘁血蓝素进行交联，能显著增加抗原的大小和免疫原性，从而制备出人工免疫原。免疫动物所述的制备方法，其抗原肽-交联载体蛋白做为免疫原，免 疫家兔制备抗体。选取适龄免疫用新西兰兔，经过适应性饲养后进行多点 注射免疫。反复加强免疫，至取血测抗体效价达到标准时停止免疫。抗体纯化达到要求的免疫动物放血，标准方法收集抗血清，依次使 用辛酸-硫酸铵方法和亲和层析过柱纯化方法，进行抗血清纯化，通过SDS-PAGE和HPLC验证纯度，得到目标抗体。本专利技术制备的高质量多肽抗体效价高、亲和力强，可与天然人DBF4B 分子发生特异性结合反应。用多肽制备抗体的成本较常规的重组抗原制备 抗体方法低，抗体特异性好，经亲和层析纯化后可以用于各种酶免检测和 WB试验要求，可用于建立体外免疫分析。该合成肽抗体的制备，为人DBF4B分子的研究及其相关疾病的研究(如诊断策略的制定，流行病学调查、预防和控制)提供了一个重要的工具，以及在生物医学研究中对相 应靶蛋白的特性、含量的测定、分布情况的分析和蛋白的确证等方面都具 有重要作用。附图说明图1是液相色谱鉴定合成多肽纯度结果图。图2是质谱鉴定合成多肽分子量结果图。图3是通过ELISA方法鉴定纯化抗体相对亲和常数结果图。图1表明经过HPLC对合成的多肽进行纯化后，液相色谱鉴定纯度 为95.5%。图2表明多肽分子量理论值为1700，质谱鉴定实测值M+H+为 1701.4。图3中间接ELISA检测制备的多抗和多肽抗原亲和常数为 109-1010L/mol。具体实施例方式实施例1:人DBF4B抗原肽的合成。用DNAstar， OMIGA， UWGCG等蛋白分析软件，对人DBF4B氨基 酸序列进行亲水性结构(hydrophilicity)、抗原指数(antigenicity)、表面可及 性(surface probability)以及同源性(homology)等分析，再结合我们己有实 际制备抗体的验证经验，最终确定第38到第52位为靶标，其氨基酸序列 为KNSPGARKHPFSGKS。在全自动多肽合成仪上由固定羧基向氨基端 递减合成后获得粗品。经30。/。乙睛溶解后，进行高压液相色谱(HPLC) 分析，计算主峰面积并收集，经冷冻真空抽干后纯化合成肽，质谱鉴定。实施例2:合成多肽与载体的偶联。载体蛋白选择KLH (Keyhole limpet hemocyanin)，用双功能试剂 顺丁烯酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯(MBS)连接法将KLH与合成肽进行偶联 取KLH5mg (0.11|jmol，含赖氨酸2.2|jmol)，溶于0.75mL偶联缓冲液 1 (50mmol/L硼酸盐缓冲液，pH8.5) ; 3mg MBS (11|jmo)溶于75|jL 二甲酰胺(DMF)。将MBS'溶液分3次加入KLH溶液，旋转混匀，室温 作用30分钟。迅速离心后，将反应混合物(约0.8mL)加入预先用偶联 缓冲液2(0.1mol/L磷酸盐，0.15mol/LNaCL， 0.01mol/LNa2EDTA， pH7.0) 平衡的PD-10柱。用偶联缓冲液2洗脱，收集洗脱液(即MBS-KLH溶 液)。溶解1.5mg合成多肽于0.15mL偶联缓冲液2，加入MBS-KLH缓 冲液0.56，室温下旋转混合，作用2小时后置4。C过夜，将反应混合物 (约0.7mL)加入预先用磷酸缓冲液平衡的PD-10柱，磷酸缓冲液洗脱， 收集流出液。将KLH、 MBS:KLH和偶联物进行SDS-KLH和偶联物进行 SDS-PAGE (聚丙烯酰胺凝胶电泳)鉴定偶联效率。取偶联的KLH-多肽500pg，溶于500|jL磷酸缓冲液，加等体积完全 福氏佐剂。免疫选取适龄免疫用新西兰兔(体重标准为2-2.5公斤)，经 过适应性词养后，背部皮内不少于15点注射。2周后抗原量减半(25CHjg), 加等体积的不完全福氏佐剂，第一次加强免疫。2周后进行第二次加强免 疫，方法同前。再2周后耳缘静脉少量采血，用合成多肽(1|jg/mL)包 被酶标板，间接ELISA法检测免疫血清效价。反复加强免疫，至取血测抗 体效价达到1: 16万时停止免疫，采用颈动脉放血收集抗体。实施例4:亲和层析纯化抗多肽抗体。① 人DBF4B合成多肽亲和层析柱的制备称取1.5g CNBr活化 S印harose4B，用1mmol/L盐酸充分浸洗膨胀凝胶后，再用偶联缓冲液 洗2次，迅速与溶于5mL偶联缓冲液的合成多肽500ijg混合，室温下旋 转混合2小时。加入0.2mol/L甘氨酸4mL终止反应，室温下旋转混合1 小时。用偶联缓冲液和甘氨酸缓冲液交替洗凝胶各2次，再用50mL磷酸 盐缓冲液洗凝胶，按终止浓度0.02%加叠氮钠(NaN3)，置4。C保存。② 亲和层析纯化抗多肽抗体:将20mL兔抗多肽血清与1.6mL多肽偶 联的S印harose4B共同加入50mL离心管，4。C旋转混合6小时。将凝 胶加入层析柱，弃去流出液，用15mL磷酸盐缓冲液冲洗凝胶。每次加 0.8mLpH2.9， 0.1mol/L甘氨酸缓冲液洗脱，共8次，洗脱液分别加入8 支预先加入80|jL 2mol/L Tris-HCL缓冲液(pH7.5) ， 20mL磷酸盐缓冲 液洗凝胶。上述全部操作过程在4。C下完成。每管取洗脱液2)JL，稀释 50倍后测280nm的OD值，计算蛋白质含量并绘制洗脱曲线。实施例5:抗体的鉴定，使用间接ELISA方法检测抗体相对亲和常数。用合成肽交联BSA，分别以5 ug/mL和10 ug/mL的浓度，在4 度下包被ELISA检测板过夜，10%的山羊血清室温封闭2小时后加入倍 比稀释的已知蛋白浓度的纯化后的抗体，再加入HRP标记的羊抗兔lgG 二抗0.1mL， TMB显色测定A4本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种Ｎ端特异的人ＤＢＦ４Ｂ多肽，其特征在于多肽的氨基酸序列为：ＫＮＳＰＧＡＲＫＨＰＦＳＧＫＳ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杜宏武，陈光宇，王德仙，陈吾奇，
申请(专利权)人：北京意宏安生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。