从羽毛中提取角蛋白的方法技术

本发明专利技术提供了一种从羽毛中提取角蛋白的方法，该方法是将干净的羽毛粉碎后经过乙醇、盐酸预处理之后，采用巯基乙醇还原法还原得到羽毛角蛋白溶液，然后经酸沉、洗涤、干燥，得到干净的土白色角蛋白固体粉末。通过紫外－可见光谱、红外光谱、ＳＤＳ－凝胶电泳以及元素分析等方法对提取的角蛋白进行了分析与表征。结果发现：本发明专利技术提取的角蛋白中主要元素为Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ，其总量在９９％以上，纯度较高；角蛋白分子量主要分布在５～２０ｋＤ以及４０～８０ｋＤ。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于高分子
，涉及一种角蛋白的提取方法，尤其涉及一种 从废弃羽毛中提取角蛋白的方法。
技术介绍
角蛋白是外胚层细胞的结构蛋白，广泛存在于生物体的组织结构中。包括 皮肤以及皮肤的衍生物发、毛、鳞、羽、甲、蹄、角、爪、喙、丝等。作为 一种天然高分子材料，角蛋白不仅来源丰富，价格低廉，且具有一些良好的特 殊性能，可被广泛应用，具有很好的经济效益与发展前景。例如，角蛋白水解产物可作为动物饲料的添加剂；其改性产物对皮革，橡胶等进行填充，可制备性能优良的皮革及橡胶产品；在角蛋白溶液中添加具有特殊功能的粉体，可以生产具有特殊功能的再生纤维。角蛋白作为一种天然的蛋白质，具有非常好的 生物相容性和细胞亲和性，具有一定的力学性能、可加工，最主要的是具有生 物可降解性，作为生物医用高分子材料将具有良好的发展前景。但是在通常情况下，角蛋白分子内的二硫键、氢键和离子键等空间横向联 键使肽链内部和相邻肽链之间发生交联，形成立体网状结构，使天然角蛋白质 在水或其它许多溶剂中都不能溶解，且表现出很强的韧性和机械强度，给角蛋 白的提取与利用带来困难。常用的角蛋白的提取方法有机械法、化学法和微生物降解法。机械法主要 是通过加热加压的方法，使角蛋白分子间甚至分子内的双硫键断裂水解，从而得到可溶性的角蛋白。如郭素华等用加热高压膨化方法使角蛋白分子中的S-S 键断裂来提取角蛋白，该法效率较高，但需要加压，且获得的角蛋白分子量不 高， 一般为多肽化混合物。微生物降解法是利用微生物的角蛋白酶，在相对温 和的条件下将角蛋白水解为氨基酸和多肽，产品纯度高且可节约能源，但过程 较为烦琐，鲜有实际应用。化学法又可分为酸碱水解法、氧化法、还原法等。 化学法也可与其它方法结合使用。由于各种化学方法的作用原理不同，得到的 角蛋白的产率和分子量也不同。酸碱水解法就是在酸或碱存在的条件下，破坏 角蛋白分子中的二硫键增大角蛋白的溶解度，从而获得可溶性角蛋白的方法。例如尹国强利用亚硫酸氢钠溶液对羽毛进行预处理，采用氢氧化钠溶液水解羽毛制得可溶性羽毛蛋白，最佳条件下收率为65.7%。该方法一般在短时间内 可获得分子量较大的角蛋白，可是角蛋白的收率偏低；而在较长时间下又容易 使得角蛋白分子中的肽键发生断裂，获得的产品分子量较低，制得的可溶性角 蛋白产品收率越高则其分子量会越小。氧化法的基本原理是使用氧化剂把角蛋 白中的二硫键氧化成磺酸基，从而获得可溶性角蛋白。例如，R.J凯利等用 Na2S03磺化和氢氧化铜铵氧化，使胱氨酸基转化为S-硫代半胱氨酸，同时采用 温和的重力进料过滤系统离心分离凝胶状角蛋白。该法在氧化过程中，不可避 免的会出现肽链氧化断裂的现象，因此氧化法所获得的角蛋白平均分子量不 高。还原法是利用还原剂将角蛋白分子中的二硫键还原成巯基，从而获得可溶 性角蛋白的基本方法。选用适当的还原剂，使其只作用于二硫键而不破坏肽键， 可以使角蛋白保持较高的分子量。例如，王开利等人采用组合还原剂处理、碱 提取的方法得到的羊毛角蛋白原液，主要分子量分布在40-80KD。张志等人采 用尿素溶解法溶解废弃羊毛，得到的原液虽然有较高的分子量，但经氧化交联 后的固体产率不高，且产物颜色同原料，也就是产物纯度不高。以上还原法均 是对羊毛进行处理，得到羊毛角蛋白溶液。羽毛是一种性能优良的蛋白质材料，然而众多的家禽养殖企业却将其作为 副产物随意丢弃，造成了严重的资源浪费，同时也给环境带来了很大压力。因 此，对丰富、廉价的羽毛的利用具有很好的经济效益和环境效益。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种从废弃羽毛中提取角蛋白的方法。本专利技术，包括以下工艺步骤① 乙醇预处理将干净的羽毛粉碎后置于反应器中，加入羽毛粉末质量30 50倍量、浓度 为75%~95°/。的乙醇，在20 80。C搅拌l 6h，过滤，然后依次用75% ~ 95% 的乙醇、蒸馏水分别洗涤，得脱脂羽毛；② 盐酸预处理将脱脂羽毛置于反应器中，先加入脱脂羽毛质量0.8 1.4倍量、浓度36~ 38%的盐酸，再加入脱脂羽毛质量10 30倍量、浓度为75% 95%的工业乙 醇及脱脂羽毛质量30 50倍量的蒸馏水，在20 10(TC搅拌l 6h;过滤，并用 蒸馏水洗涤数次，冷冻干燥后得盐酸预处理羽毛；③ 巯基乙醇还原将盐酸预处理羽毛置于反应器中，分别加入脱脂羽毛质量30 50倍量的 蒸馏水、0.03 ~0.08倍量的Tris (三羟甲基氨基甲烷)、0.8 1.2倍量的SDS (十 二垸基硫酸钠)、1 3倍量的尿素、0.2 1.2倍量的巯基乙醇，通氮气保护， 于20 10(TC搅拌l~6h;过滤，收集滤渣和滤液；滤液即为角蛋白溶液；④ 角蛋白沉淀将滤液用浓盐酸调节pH至2.0 5.0，滤液中出现大量沉淀；过滤，用蒸馏 水洗涤，以除去其中未反应的原料；干燥，得到纯净的土白色羽毛角蛋白粉末。下面通过紫外-可见光谱，红外光谱，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、热重分 析以及元素分析对本专利技术提取的角蛋白的结构、分子量及元素含量进行表征。1、紫外-可见光谱分析将角蛋白溶解在碱性溶液(稀NaOH)中，采用双光束紫外可见分光光度 计(TU-1901，北京普析通用仪器有限责任公司)，测定其紫外-可见吸收光谱 图。测定结果发现角蛋白在289nm、 239nm处有吸收峰。其中，289 nm处 的吸收是由于色氨酸残基和酪氨酸残基特征吸收发生迁移所致；239 nm处的 吸收是苯丙氨酸的特征吸收峰。由此可知，角蛋白中含有色氨酸、酪氨酸和苯 丙氨酸。2红外光谱分析采用红外光谱扫描仪(FTS3000，美国DigiLAB Merlin);测定本专利技术提 取的角蛋白的红外光谱，并进行数据分析，发现3293 cm"出现0-H伸縮振动 强吸收峰;3082 cm"出现不饱和烃中OH伸縮振动吸收峰;2970cm"出现-013 反对称C-H伸縮振动；2866 cm—1出现-CH3对称C-H伸縮振动；2935 cm—1出现 -CH2-伸縮振动。582 cm—1出现二硫键S-S伸縮振动吸收；711 cm"出现酰胺键 中-N-H面外弯曲振动；879 cm"出现不饱和烃上C-H伸縮变形振动；1055 cm" 出现酰胺键的C-N伸縮振动；1240 cm"出现羧基中的C-0伸縮振动；1460 cm—1 出现-CH2-的变形振动；1548cm"出现酰胺键(仲酰胺)的(C=0)伸縮振动； 1662 cm—1出现酰胺键(伯酰胺)的(C=0)伸縮振动。可以看出，角蛋白中 存在蛋白的特征官能团肽键的吸收，且由582 cm"处的吸收可知角蛋白中存在 较多的二硫键。3、 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳釆用电泳仪(DYY-12C型，北京六一仪器厂)，并应用SDS-聚丙烯酰胺 凝胶电泳技术对角蛋白的分子量及分子量分布进行了考察，发现角蛋白分子量主要分布在5kD 20kD，同时在40kD 80kD也有少量分布，而且基本呈线性分布o4、 热重分析对本专利技术提取的角蛋白进行热重分析，发现其具有良好的热稳定性，24(TC以下不发生变化。5、 元素分析及X射线荧光光谱分析用元素分析仪(GmbHVarioEL型，德国产)及X射线荧光光谱仪对提取的角蛋白进行元素含量分析。分析结果可知本专利技术提取的角蛋白中主要元 素为C、H、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从羽毛中提取角蛋白的方法，包括以下工艺步骤：　①乙醇预处理　将干净的羽毛粉碎后置于反应器中，加入羽毛粉末质量３０～５０倍量、浓度为７５％～９５％的乙醇，在２０～８０℃搅拌１～６ｈ，过滤，然后依次用７５％～９５％的乙醇、蒸馏水分别洗涤，得脱脂羽毛；　②盐酸预处理　将脱脂羽毛置于反应器中，先加入脱脂羽毛质量０．８～１．４倍量、浓度为３６％～３８％的盐酸，再加入脱脂羽毛质量１０～３０倍量、浓度为７５％～９５％的工业乙醇及脱脂羽毛质量３０～５０倍量的蒸馏水，在２０～１００℃搅拌１～６ｈ；过滤，并用蒸馏水洗涤，干燥后得盐酸预处理羽毛；　③巯基乙醇还原　将盐酸预处理羽毛置于反应器中，分别加入脱脂羽毛质量３０～５０倍量的蒸馏水、０．０３～０．０８倍量的三羟甲基氨基甲烷、０．８～１．２倍量的十二烷基硫酸钠、１～３倍量的尿素、０．２～１．２倍量的巯基乙醇，通氮气保护，于２０～１００℃搅拌１～６ｈ；过滤，收集滤渣和滤液；滤液即为角蛋白溶液；　④角蛋白沉淀　将滤液用浓盐酸调节ｐＨ至２．０～５．０，滤液中出现大量沉淀；过滤，用蒸馏水洗涤，干燥，得到纯净的土白色羽毛角蛋白粉末。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王荣民，李芳莹，何玉凤，贾如琰，
申请(专利权)人：西北师范大学，
类型：发明
国别省市：62[中国|甘肃]