一种基于低温快速成型的组织工程支架及制备方法技术

本发明专利技术涉及一种基于低温快速成型的组织工程支架及其制备方法，该方法包括：将聚乳酸‑羟基乙酸共聚物与有机溶剂以1:6～1:8的质量比混合配置PLGA溶液，并加入氯化钠颗粒得到打印浆料，其中氯化钠颗粒与PLGA的质量比为1:2～2:1；将纤维直径设置为200～300μm，纤维间距设置为300～350μm，以3～6mm/s的速度打印出含有氯化钠颗粒的支架本体，去除有机溶剂和氯化钠后得到基于低温快速成型的组织工程支架。本发明专利技术通过添加赋形剂实现了PLGA材料的低温打印，克服了高温熔融打印PLGA支架造成的孔径尺寸过大或者过小的缺陷，制得的PLGA支架的孔径适中，易于存留细胞，同时兼备良好的生物力学性能。

Tissue engineering support based on low temperature rapid prototyping and preparation method

The invention relates to a tissue engineering scaffold and a preparation method of low temperature based on rapid prototyping, the method comprises: poly lactic acid glycolic acid and organic solvent by 1:6 ~ 1:8 mass ratio of the configuration of the PLGA solution, and adding sodium chloride particles in the printing paste, the quality of sodium chloride particles and the ratio of PLGA 1:2 ~ 2:1; the fiber diameter is set to 200 ~ 300 m, fiber spacing to 300 ~ 350 m, 3 ~ 6mm/s for the speed of print out the bracket body containing sodium chloride particles, removal of organic solvent and sodium chloride after cryogenic tissue engineering scaffold based on rapid prototyping. The invention realizes low temperature by adding excipient printing material PLGA, overcomes the pore size of high temperature melting printing PLGA stent caused by too large or too small defects, PLGA scaffolds prepared by pore size, easy to preserve cells, biomechanical properties and good.

【技术实现步骤摘要】
一种基于低温快速成型的组织工程支架及制备方法
本专利技术涉及生物材料与组织工程
，尤其涉及一种基于低温快速成型的组织工程支架及制备方法。
技术介绍
传统的组织工程支架制备技术包含有:纤维粘接技术、溶液浅铸/颗粒滤出技术、气体发泡技术、相分离技术、乳液冷冻干燥技术等。但是这些传统技术都有共同的缺点：孔径不一致，孔隙的形状不规则，孔隙间的连通性不足，可重复性差。相比之下，作为快速成型技术的一种，3D打印技术制备的组织工程支架具有独特优势：支架个性化、孔径尺寸可调节、孔隙率可控、孔隙联通性好，并可设计孔的形状，以及构建复杂空间结构。此外，3D打印技术具有优良的可重复性和生产效率，尤其可根据需求模拟天然组织的结构。熔融沉积成型(FusedDepositionModeling，FDM)是目前制作组织工程支架较常用的方法。FDM是将低熔点丝状材料通过加热器的挤压头熔化成液体，使熔化的热塑材料丝通过喷头挤出，挤压头沿零件的每一截面的轮廓准确运动，挤出半流动的热塑材料沉积固化成精确的实际部件薄层，覆盖于已建造的零件之上，并在1/10s内迅速凝固，每完成一层成型，工作台便下降一层高度，喷头再进行下一层截面的扫描喷丝，如此反复逐层沉积，直到最后一层，这样逐层由底到顶地堆积成一个实体模型或零件。采用该技术构建组织工程支架首先要解决材料问题，因材料加工时要经过熔融挤压程序且材料必须为丝状，熔融沉积制造工艺几乎不能使用天然的聚合物，也不适于部分粘度大的合成物。同时，材料在堆积凝固过程中会阻碍微孔的形成，而微孔是促进细胞吸附的重要因素之一。目前熔融沉积成型技术通常采用聚己内酯(polycaprolactone，PCL)作为原料来制备组织工程支架。PCL是一种常用的具有生物相容性和生物可降解性的高分子材料，其可塑性强且生物力学强度高，但是因为不易于降解，因此不适合用于组织工程骨或者软骨的构建。聚乳酸-羟基乙酸共聚物(glycolicacid，PLGA)因其具有良好的生物可降解性、生物相容性等，己被美国食品药品管理局FDA广泛的应用于生物医学领域。但是，现有技术中通常采用电纺丝技术制备PLGA三维支架，而熔融沉积打印PLGA支架的成功率很低。这是由于纯PLGA材料在高温熔融(例如150～220℃)后粘度较大，容易堵塞打印喷嘴，且PLGA的结晶度低，打印出的纤维不易成型，容易发生塌陷和向两侧弥散，使临近纤维之间产生粘连导致孔径闭合，例如孔径通常小于100μm。如果为了避免粘连而减小纤维直径，则打印出的纤维强度不够，不能成行。如果增大纤维直径，例如300～600μm，也不能有效避免粘连现象，还容易因为塌陷而出现极小的孔径。为了避免上述情况，只能在设计时考虑增加纤维间距，因此熔融沉积成型采用高温打印出的PLGA支架的孔径通常大于500μm。即使能够用尽可能细的纤维，打印出尽可能合理的孔径300μm，但是其重复性很低，而且材料的脆性大，生物力学强度低，无法满足软骨支架的修复要求。综上所述，现有技术中熔融沉积成型在高温下打印的纯PLGA支架存在孔径尺寸过大(>500μm)或者过小(<100μm)的缺陷，不易于准确控制3D打印PLGA支架的微观结构，且缺少内部微孔，不适于细胞在支架上的吸附和增殖。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，针对现有熔融沉积成型的纯PLGA支架孔径过大或过小且形态不规则的缺陷，提供一种复合赋形剂的基于低温快速成型的组织工程支架及制备方法。本专利技术第一方面，提供了一种基于低温快速成型的组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：(1)将聚乳酸-羟基乙酸共聚物与有机溶剂以1:6～1:8的质量比混合，配置PLGA溶液；(2)在所述PLGA溶液中加入氯化钠颗粒得到打印浆料，其中氯化钠颗粒与PLGA的质量比为1:2～2:1；(3)将所述打印浆料置入熔融沉积成型三维打印机的喷头内，并在20～30℃温度及100～300kPa的气压下准备打印；(4)将纤维直径设置为200～300μm，纤维间距设置为300～350μm，以3～6mm/s的速度打印出含有氯化钠颗粒的支架本体；(5)去除含有氯化钠颗粒的支架本体中的有机溶剂；(6)将含有氯化钠颗粒的支架本体置入水中浸泡，待氯化钠溶出后干燥得到所述基于低温快速成型的组织工程支架。在根据本专利技术所述的基于低温快速成型的组织工程支架的制备方法中，所述制备方法还包括在步骤(6)之后执行的以下步骤(7)：将骨髓间充质干细胞悬液加入水凝胶溶液中，制备水凝胶细胞混合悬液，将所述水凝胶细胞混合悬液滴加于所述组织工程支架上，直至水凝胶细胞混合悬液渗透入所述组织工程支架的孔隙结构中并覆盖组织工程支架表面。在根据本专利技术所述的基于低温快速成型的组织工程支架的制备方法中，所述水凝胶为聚氨基类水凝胶；所述步骤(7)进一步包括：将聚氨基类水凝胶与磷酸缓冲盐溶液在4～6℃充分搅拌溶解后形成水凝胶溶液，其中聚氨基类水凝胶的质量分数为4％～12％；将水凝胶溶液与骨髓间充质干细胞悬液在18～22℃时混合均匀形成包裹细胞的水凝胶细胞混合悬液；其中，水凝胶细胞混合悬液中骨髓间充质干细胞的细胞浓度为5×105～2×106/ml；将所述水凝胶细胞混合悬液滴加于所述组织工程支架上，置于离心管中，在4℃以180～220rpm/min离心10～20分钟；取出离心后的组织工程支架置于37℃环境下保存。在根据本专利技术所述的基于低温快速成型的组织工程支架的制备方法中，所述聚氨基类水凝胶为通过以下方法制备的RGD-PEG-PELG-KGN：以aPEG-NH2为大分子引发γ-乙基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐开环聚合得到聚乙二醇-聚(γ-乙基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物aPEG-PELG13；在aPEG-PELG13的两端分别连接RGD肽以及小分子化合物KGN构成RGD-PEG-PELG-KGN。在根据本专利技术所述的基于低温快速成型的组织工程支架的制备方法中，制备聚乙二醇-聚(γ-乙基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物的步骤具体为：将aPEG-NH2与甲苯混合后在120～140℃下共沸除水，抽干甲苯后，按照1:1.2～1:1.8的质量比加入γ-乙基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐，并溶解于干燥的DMF中在22～26℃且氮气保护条件下反应72～120h，然后用冰乙醚沉降2～4次，并在室温条件下真空干燥后得到aPEG-PELG13。在根据本专利技术所述的基于低温快速成型的组织工程支架的制备方法中，制备RGD-PEG-PELG-KGN的步骤具体为：将aPEG-PELG13溶于DMF中配制浓度为0.1～0.15g/ml的聚氨基酸DMF溶液；再将KGN溶于DMF中配制浓度为0.03～0.04g/ml的KGN溶液，用EDC/NHS活化后在冰水浴中缓慢滴加到聚氨基酸DMF溶液中，其中aPEG-PELG13和KGN的用量比为(4.3～5)：1，搅拌反应2～4h，用截留量为3000的透析袋在水中透析2～4天后冻干得到aPEG-PELG-KGN待用；将aPEG-PELG-KGN、CRGD和偶氮二异丁腈以(79～82)：(58～62)：(3～4)的质量比溶于DMF溶液中，放入安全瓶中在液氮条件下冻实后用高压油泵抽15～25min，充入氮气保护，融化后再抽15～25min，重复3次以除本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于低温快速成型的组织工程支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将聚乳酸‑羟基乙酸共聚物与有机溶剂以1:6～1:8的质量比混合，配置PLGA溶液；(2)在所述PLGA溶液中加入氯化钠颗粒得到打印浆料，其中氯化钠颗粒与PLGA的质量比为1:2～2:1；(3)将所述打印浆料置入熔融沉积成型三维打印机的喷头内，并在20～30℃温度及100～300kPa的气压下准备打印；(4)将纤维直径设置为200～300μm，纤维间距设置为300～350μm，以3～6mm/s的速度打印出含有氯化钠颗粒的支架本体；(5)去除含有氯化钠颗粒的支架本体中的有机溶剂；(6)将含有氯化钠颗粒的支架本体置入水中浸泡，待氯化钠溶出后干燥得到所述基于低温快速成型的组织工程支架。

【技术特征摘要】
1.一种基于低温快速成型的组织工程支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将聚乳酸-羟基乙酸共聚物与有机溶剂以1:6～1:8的质量比混合，配置PLGA溶液；(2)在所述PLGA溶液中加入氯化钠颗粒得到打印浆料，其中氯化钠颗粒与PLGA的质量比为1:2～2:1；(3)将所述打印浆料置入熔融沉积成型三维打印机的喷头内，并在20～30℃温度及100～300kPa的气压下准备打印；(4)将纤维直径设置为200～300μm，纤维间距设置为300～350μm，以3～6mm/s的速度打印出含有氯化钠颗粒的支架本体；(5)去除含有氯化钠颗粒的支架本体中的有机溶剂；(6)将含有氯化钠颗粒的支架本体置入水中浸泡，待氯化钠溶出后干燥得到所述基于低温快速成型的组织工程支架。2.根据权利要求1所述的基于低温快速成型的组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括在步骤(6)之后执行的以下步骤(7)：将骨髓间充质干细胞悬液加入水凝胶溶液中，制备水凝胶细胞混合悬液，将所述水凝胶细胞混合悬液滴加于所述组织工程支架上，直至水凝胶细胞混合悬液渗透入所述组织工程支架的孔隙结构中并覆盖组织工程支架表面。3.根据权利要求2所述的基于低温快速成型的组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述水凝胶为聚氨基类水凝胶；所述步骤(7)进一步包括：将聚氨基类水凝胶与磷酸缓冲盐溶液在4～6℃充分搅拌溶解后形成水凝胶溶液，其中聚氨基类水凝胶的质量分数为4％～12％；将水凝胶溶液与骨髓间充质干细胞悬液在18～22℃时混合均匀形成包裹细胞的水凝胶细胞混合悬液；其中，水凝胶细胞混合悬液中骨髓间充质干细胞的细胞浓度为5×105～2×106/ml；将所述水凝胶细胞混合悬液滴加于所述组织工程支架上，置于离心管中，在4℃以180～220rpm/min离心10～20分钟；取出离心后的组织工程支架置于37℃环境下保存。4.根据权利要求3所述的基于低温快速成型的组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述聚氨基类水凝胶为通过以下方法制备的RGD-PEG-PELG-KGN：以aPEG-NH2为大分子引发γ-乙基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐开环聚合得到聚乙二醇-聚(γ-乙基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物aPEG-PELG13；在aPEG-PELG13的两端分别连接RGD肽以及小分子化...

【专利技术属性】
技术研发人员：余家阔，王少杰，朱钰方，董亮，
申请(专利权)人：北京大学第三医院，上海理工大学，
类型：发明
国别省市：北京,11