一种四价亚单位流感疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术涉及生物制药领域，具体公开了一种四价亚单位流感疫苗及其制备方法。所用毒种分别是H1N1型(NYMC X‑179A)，H3N2型(NIB‑88)，BY型(B/Phuket)，BV型(NYMC BX‑35)。毒种经鸡胚培养，通过尿囊液收获、澄清、浓缩、纯化等步骤制备出单价病毒原液，然后将四个不同血清型的病毒单价原液按一定稀释点配比，制备出四价亚单位流感疫苗样品。该四价亚单位疫苗样品中较低的卵清蛋白含量和较低的甲醛及裂解剂残留量，保证了四价亚单位疫苗的不良反应更低，提高了疫苗的安全性。同时，四价亚单位疫苗相比现有的三价疫苗增加了一个BV血清型，针对不同血清型流感的流行具有更宽泛的防御保护范围。

A tetravalent subunit influenza vaccine and preparation method thereof

The present invention relates to the field of biological pharmacy, in particular discloses a tetravalent subunit influenza vaccine and preparation method thereof. The virus is H1N1 type (NYMC X 179A), H3N2 (NIB 88), BY (B/Phuket), BV (NYMC BX 35). Virus by chick embryo culture by allantoic fluid, clarification, concentration and purification steps of preparation of monovalent virus solution, and then four different serotypes of the virus at some point solution according to the dilution ratio, prepare tetravalent subunit influenza vaccine samples. The low content of ovalbumin tetravalent subunit vaccine samples and formaldehyde and low residue cracking agent, the lower adverse reaction tetravalent subunit vaccine, improves the safety of the vaccine. At the same time, the tetravalent subunit vaccine compared to the existing trivalent vaccine adds a BV serotype, different serotypes of influenza for a broader range of protection.

【技术实现步骤摘要】
一种四价亚单位流感疫苗及其制备方法
本专利技术涉及生物制药领域，具体地说，涉及一种四价亚单位流感疫苗。
技术介绍
流感是由流感病毒引起的，可造成大规模流行的急性呼吸道传播疾病。流感能在短期内突然发生，迅速蔓延，造成不同程度的流行，包括世界大流行，局部暴发流行及散发。高危人群为年迈体弱或带有慢性疾病患者。每次流感流行后在人群中总要造成不同程度的超额死亡。因此，流感的预防一直受到世界各国的高度重视。预防流感最有效的措施是接种流感疫苗。目前全世界使用的流感疫苗都是三价的，包括两种甲型(H1N1，H3N2)和一种乙型(B型)流感病毒抗原成分，现在应用最广泛的疫苗包括用于6月以上人群的灭活疫苗和用于2-49岁的减毒活疫苗。灭活疫苗包括裂解疫苗和亚单位疫苗。裂解疫苗是将病毒在鸡胚内培养来制备病毒液,收获尿囊液后，经澄清、浓缩、纯化、灭活、裂解后制备出裂解疫苗半成品，将三价病毒原液按一定比例配比成裂解疫苗成品。亚单位疫苗是在裂解疫苗的基础上，通过适宜的裂解剂、裂解条件，将膜蛋白HA和NA裂解下来，选择适当的纯化方法获得HA和NA蛋白，制备而成。三价疫苗对流感的预防明显受限。市场上使用的三价疫苗只含甲1型(H1N1)、甲3型(H3N3)和一个谱系的乙型(B型)流感病毒抗原。三价疫苗对另一谱系乙型病毒仅提供有限保护。综上所述，为了增强产品的安全性，扩大人群对流感不同流行型别的保护范围，为全人群提供免疫保护屏障，特别是对6月以下婴幼儿及老年人的保护，流感疫苗市场亟需四价亚单位流感疫苗的开发和应用。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种四价亚单位流感疫苗及其制备方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供了一种四价亚单位流感疫苗，其由H1N1型、H3N2型、BY型和BV型的病毒单价原液按一定稀释点配制而成；所述疫苗中H1N1型、H3N2型、BY型和BV型的血凝素含量均为26.4μg-39.6μg/mL。配制方法具体为：根据各单价原液的血凝素含量，将各型流感病毒按同一血凝素含量进行半成品配制(血凝素配制量可在30～36μg/mL范围内，每年各型流感病毒株应按同一血凝素含量进行配制)，即为半成品。根据所需单价原液稀释液的体积为V和单价原液血凝素含量C0，计算出所需单价原液的体积V0＝V/(C0/血凝素配制量)，0.01mol/L磷酸盐缓冲液的体积VP＝V-V0。以一批单价原液为例：假如某批所需单价原液稀释液的体积为500mL，单价原液的血凝素含量为350μg/mL，血凝素配制量为35μg/mL，那么单价原液体积为500/(350/35)＝50mL，0.01mol/L磷酸盐缓冲液的体积500mL-50mL＝450mL。进一步地，所述病毒单价原液由毒种经鸡胚培养、通过尿囊液收获、澄清、浓缩、裂解、纯化后得到；毒种为经世卫组织(WHO)评估后推荐，由英国生物制品检定研究所(NIBSC)提供的人用流感疫苗病毒株，分别是H1N1型(NYMCX-179A)，H3N2型(NIB-88)，BY型(B/Phuket)，BV型(NYMCBX-35)。其中，浓缩步骤具体为：1)将单型流感病毒的尿囊收获液经离心澄清后，用100万截留分子量超滤膜对其进行超滤浓缩，浓缩倍数20～60倍。所述裂解步骤具体为：1)将浓缩后的病毒液置于浓度不高于1.5％的裂解剂TritonN101/蔗糖溶液中，于15～25℃条件下，裂解3.5～4.5h；裂解的同时进行蔗糖密度梯度离心，根据紫外吸收曲线收集目的蛋白峰，收集蔗糖浓度为9％～20％之间的蛋白峰；进行蔗糖密度梯度离心时，离心转速为25000转/分钟，离心时间3.5～4.5h；或2)：将浓缩后的病毒液置于浓度不高于1.5％的裂解剂TritonN101中，于15～25℃条件下，裂解0.5～2h；裂解后的病毒液在疏水层析柱HiTrapPhenylFF(highsub)进行分离纯化，上样缓冲液为50mmol/LPBS+1.5mol/L(NH4)2SO4(pH7.0)，含硫酸铵100％，另设50mmol/LPBS中含硫酸铵为0，适量上样后以保证柱压的流速从设定的硫酸铵含量100％至0速递减洗脱，以280nm波长进行监测，并收集蛋白峰。进一步地，本专利技术以毒种出发，提供完整的所述病毒单价原液的制备方法，包括如下步骤：S1、病毒接种和培养将单型工作种子批毒种稀释到终浓度为2.0lgEID50/mL～5.0lgEID50/mL范围内后，以0.2mL/胚的剂量接种于鸡胚尿囊腔，置33～35℃培养48～72小时；S2、病毒收获筛选活鸡胚，置2～8℃冷胚12～24小时后，收获尿囊液；S3、离心澄清合并将单型流感病毒的尿囊收获液经离心澄清后合并为单价病毒合并液；S4、浓缩、病毒裂解和纯化S41、浓缩用100万截留分子量超滤膜对单价病毒合并液进行超滤浓缩，浓缩倍数20-60倍；S42、病毒裂解将浓缩后的病毒液置于浓度不高于1.5％的裂解剂TritonN101/蔗糖溶液，置于15～25℃，病毒裂解时间3.5～4.5小时，蔗糖密度梯度离心时间3.5～4.5小时，离心转速为25000转/分钟，根据紫外吸收曲线收集目的蛋白峰，收集蔗糖浓度为9％～20％之间的蛋白峰；S43、纯化收集密度梯度离心后的病毒液，Sephadex-G25为介质进行凝胶层析，洗脱液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液，根据紫外吸收曲线收集，经稀释、除菌过滤，对除菌过滤后层析液的蛋白质含量进行检测，应不高于2500μg/mL，如果高于2500μg/mL应稀释至该浓度，加入终浓度为200μg/mL的甲醛置2～8℃灭活2天，得到病毒灭活液；S44、再纯化对病毒灭活液进行洗滤，去除甲醛，洗滤后病毒液应取样进行细菌内毒素含量测定和微生物限度检查，微生物限度检查菌数应小于10cfu/mL，再经除菌过滤后即为病毒单价原液。更为优选地，所述病毒单价原液的制备方法包括如下步骤：S1、病毒接种和培养将单型工作种子批毒种稀释到终浓度为2.0lgEID50/mL～5.0lgEID50/mL范围内后，以0.2mL/胚的剂量接种于鸡胚尿囊腔，置33～35℃培养48～72小时；S2、病毒收获筛选活鸡胚，置2～8℃冷胚12～24小时后，收获尿囊液；S3、离心澄清合并将单型流感病毒的尿囊收获液经离心澄清后合并为单价病毒合并液；S4、浓缩、病毒裂解和纯化S41、浓缩用100万截留分子量超滤膜对单价病毒合并液进行超滤浓缩，浓缩倍数20-60倍；S42、病毒裂解将浓缩后的病毒液置于浓度不高于1.5％的裂解剂TritonN101中，置于15～25℃，病毒裂解时间0.5～2小时；之后，采用疏水层析对不同血清型样品进行分离纯化；S43、纯化收集密度梯度离心后的病毒液，Sephadex-G25为介质进行凝胶层析，洗脱液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液，根据紫外吸收曲线收集，经稀释、除菌过滤，对除菌过滤后层析液的蛋白质含量进行检测，应不高于2500μg/mL，如果高于2500μg/mL应稀释至该浓度，加入终浓度为200μg/mL的甲醛置2～8℃灭活2天，得到病毒灭活液；S44、再纯化以1万分子量超滤膜对病毒灭活液进行洗滤，去除甲醛，洗滤后病毒液应取样进行细菌内毒素含量测定和微生物限度本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种四价亚单位流感疫苗，其特征在于，由H1N1型、H3N2型、BY型和BV型的病毒单价原液制备而成；所述疫苗中H1N1型、H3N2型、BY型和BV型的血凝素含量均为26.4μg‑39.6μg/mL。

【技术特征摘要】
1.一种四价亚单位流感疫苗，其特征在于，由H1N1型、H3N2型、BY型和BV型的病毒单价原液制备而成；所述疫苗中H1N1型、H3N2型、BY型和BV型的血凝素含量均为26.4μg-39.6μg/mL。2.根据权利要求1所述的四价亚单位流感疫苗，其特征在于，所述病毒单价原液由毒种经鸡胚培养、通过尿囊液收获、澄清、浓缩、裂解、纯化后得到；其中，浓缩步骤具体为：1)将单型流感病毒的尿囊收获液经离心澄清后，用100万截留分子量超滤膜对其进行超滤浓缩，浓缩倍数20～60倍。3.根据权利要求2所述的四价亚单位流感疫苗，其特征在于，所述裂解步骤具体为：1)将浓缩后的病毒液置于浓度不高于1.5％的裂解剂TritonN101/蔗糖溶液中，于15～25℃条件下，裂解3.5～4.5h；裂解的同时进行蔗糖密度梯度离心，根据紫外吸收曲线收集目的蛋白峰，收集蔗糖浓度为9％～20％之间的蛋白峰；或2)：将浓缩后的病毒液置于浓度不高于1.5％的裂解剂TritonN101中，于15～25℃条件下，裂解0.5～2h；裂解后的病毒液在疏水层析柱HiTrapPhenylFF(highsub)进行分离纯化，上样缓冲液为50mmol/LPBS+1.5mol/L(NH4)2SO4(pH7.0)，含硫酸铵100％，另设50mmol/LPBS中含硫酸铵为0，适量上样后以保证柱压的流速从设定的硫酸铵含量100％至0速递减洗脱，以280nm波长进行监测，并收集蛋白峰。4.根据权利要求3所述的四价亚单位流感疫苗，其特征在于，进行蔗糖密度梯度离心时，离心转速为25000转/分钟，离心时间3.5～4.5h。5.根据权利要求1所述的四价亚单位流感疫苗，其特征在于，所述病毒单价原液的制备方法包括如下步骤：S1、病毒接种和培养将单型工作种子批毒种稀释到终浓度为2.0lgEID50/mL～5.0lgEID50/mL范围内后，以0.2mL/胚的剂量接种于鸡胚尿囊腔，置33～35℃培养48～72小时；S2、病毒收获筛选活鸡胚，置2～8℃冷胚12～24小时后，收获尿囊液；S3、离心澄清合并将单型流感病毒的尿囊收获液经离心澄清后合并为单价病毒合并液；S4、浓缩、病毒裂解和纯化S41、浓缩用100万截留分子量超滤膜对单价病毒合并液进行超滤浓缩，浓缩倍数20-60倍；S42、病毒裂解将浓缩后的病毒液置于浓度不高于1.5％的裂解剂TritonN101/蔗糖溶液，置于15～25℃，病毒裂解时间3.5～4.5小时，蔗糖密度梯度离心时间3.5～4.5小时，离心转速为25000转/分钟，根据紫外吸收曲线收集目的蛋白峰，收集蔗糖浓度为9％～20％之间的蛋白峰；S43、纯化收集密度梯度离心后的...

【专利技术属性】
技术研发人员：安有才，付作申，张玉辉，于海龙，陈辉黎，刘鹏，刘冰冰，安蕊，徐奇，冷文娜，陈晓芬，
申请(专利权)人：江苏中慧元通生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32