本发明专利技术涉及一种积雪草甙化学对照品的制备方法。以重量含量３０～９７％的积雪草甙提取物为原料，以制备型高效液相色谱为分离手段，以一定比例的甲醇－水溶液为洗脱体系，获得纯度大于９８％的积雪草甙化学对照品。工艺步骤有：样品预处理，色谱柱处理，进样，洗脱，在线检测，收集含有积雪草甙的洗脱液，减压浓缩积雪草甙洗脱液至干，即得积雪草甙化学对照品。经高效液相色谱法检测，积雪草甙的含量可达到９８％以上。
【技术实现步骤摘要】
絲领域本专利技术涉及一种从积雪草甙提取物中分离获得纯度大于98%的积雪草 甙化学对照品的制备方法。积雪草甙(Asiaticoside)是积雪草中一种重要的化学成分，属于五环三 萜类化合物，我国2005版国家药典中把积雪草甙作为鉴定成分。积雪草甙 的结构式如下OH OHOH积雪草甙能明显促进伤口愈合，刺激肉芽生长，促进表皮角质化，并有助于发生新的结缔组织，可用治疗烧伤，下肢溃烂，创伤，肌腱粘连等。 蒋毅等(中国专利CN 1520824A， 2004年公开)报道了积雪草甙对二甲基 亚硝胺引发的大鼠肝纤维化的防治作用，证实了积雪草甙具有抑制成纤维 细胞生长增殖的功能，进而确定积雪草甙的预防治疗肝纤维化药物作用。秦路平等(中国专利CN1211098C， 2005年公开)报道了积雪草总甙的 提取方法，该方法采用皂甙型大孔吸附树脂吸附积雪草提取物，经蒸馏水 洗脱，去除杂质后，以水醇洗脱，得到积雪草总甙溶液，以乙酸乙酯结晶， 减压浓縮至干，经核磁共振分析，所得总皂甙主要由积雪草甙和羟基积雪 草甙组成，两种成分占总该提取物的60%以上。何明芳等(中国药科大学 学报，2000,31 (2): 91 93)报道的釆用大孔吸附树脂结合硅胶柱层析的 方法获得积雪草甙的分离方法，王宝奎等(海峡药学，1996， 8 (4): 3) 报道的采用正丁醇萃取结合硅胶柱层析获得积雪草甙的分离方法，获得积 雪草式结晶。目前积雪草甙单体化合物的制备存在如下缺点1.纯度大于98%的积 雪草甙单体的获得还停留在实验室小规模水平，无法提供克级化学对照品； 2.目前可大规模提供的积雪草甙纯度最高仅能达到卯％，无法满足积雪草药材或相关制剂的质量分析及控制要求。以上两点原因制约了积雪草及积 雪草甙的科学研究及应用。开发一种可以获得克级纯度在诉％以上积雪草 甙化学对照品的方法是当前积雪草研究的难点。
技术实现思路
为克服现有技术的缺陷，优化分离条件，本专利技术的目的在于提供一种分离时间短、分离效果好、产品纯度高(纯度在98。Z以上)的积雪草甙化学 对照品的分离制备方法。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案对照品的分离制备方法，以 重量含量30 97% (优选60 97%)的积雪草甙提取物为原料，以制备型 高效液相色谱为分离手段，以甲醇-水溶液为洗脱体系，获得克级纯度98% 以上积雪草式化学对照品；具体步骤为，(1) 样品预处理将重量含量30 97%的积雪草甙提取物用甲醇或乙 醇溶液溶解，配置成重量浓度为30 60mg/ml的积雪草甙提取物溶液，经 0.22 0.45拜微孔滤膜过滤；(2) 色谱柱处理高效液相色谱柱选择制备型高效液相色谱柱，以5 一20倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱；洗脱体系溶液为甲醇水溶液， 其体积浓度为50—80%;(3) 进样将过滤后的样品溶液通过六通阀或泵进样，进样体积为l 100ml;(4) 洗脱采用洗脱体系溶液洗脱色谱柱，流速控制在10 600ml/min， 在线紫外监测，收集含有积雪草甙的洗脱液；(5) 积雪草甙化学对照品的获得减压浓縮所收集到的积雪草甙洗脱 液至干，获得纯度高于98%的积雪草甙化学对照品。所述制备型高效液相柱选用商品化或自己装填的制备型高效液相柱;其 填料可为C8或C18键合相填料；自己装填的制备型高效液相柱装填方式为 湿法装柱，填料粒径为5-20拜，柱效在2000以上；在线紫外检测，其检 测波长为190nm 220nm，具体检测波长根据样品中干扰成分与积雪草甙的 灵敏度确定，在所选择波长下，可以灵敏检测到干扰成分与积雪草甙的信 号；积雪草甙洗脱液收集后，减压浓縮，浓縮温度控制在60—70'C。以本方法从积雪草提取物中分离积雪草甙化学对照品具有如下优点和 进步1. 本专利技术以制备型高效液相为分离手段，在保证积雪草甙得到高效分 离的前提下，提高了积雪草甙化学对照品的产量，可以获得克级纯度在98 %以上的积雪草甙化学对照品。2. 本专利技术所述的甲醇-水洗脱体系能有效的保证积雪草甙与其他成分得 到有效分离，从而保证分离的效果。3. 本专利技术采用紫外检测器在线检测，检测波长为l卯至210nm间任一 波长，使积雪草甙的分离情况可以直接检测，并可以选择性收集，显著提高收集效果o4. 本专利技术所述方法操作简便，条件温和，能有效的保证积雪草甙的稳 定性。5. 可产业推广。色谱柱规格为50X250mm时，其规模可达到10克/ 月以上。附图说明图1为本专利技术实施例一制备的积雪草甙化学对照品的纯度分析色谱图。具体实n^r式下面通过实施例和附图对本专利技术做进一步详细说明。 实施例i本实施例中，以30%的积雪草甙提取物为原料，以5MmC18键合相填 料为吸附剂，以甲醇-水(50: 50，体积比)溶液为洗脱溶剂，具体工艺步 骤如下1. 样品预处理积雪草甙提取物用甲醇溶解，配置成浓度为60mg/ml的积雪草甙溶液， 经0.22拜微孔滤膜过滤。2. 色谱柱处理制备型高效液相柱选择为日本Sheshido公司生产的固定相为C18的制 备柱(5Mm， 20X250mm)，以约5倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱。3. 上样将过滤后的样品溶液通过六通阀进样，进样体积为lml。4. 洗脱流速控制在10ml/min,在线l卯nm紫外检测，收集含有积雪草甙的洗 脱液，5'.积雪草甙化学对照品的获取减压浓缩积雪草甙洗脱液，浓缩温度控制在70'C。得到纯度为99.54% 的积雪草甙化学对照品；如图1所示，其分析结果如表l所示表l峰名称保留时间A峰面积面积百分比110.06674760.462积雪草甙10.648162393299.54实施例2本实施例中，以60%积雪草甙提取物为原料，以lOnm的C8键合相填 料为吸附剂，以甲醇-水(70: 30，体积比)溶液为洗脱溶剂，具体工艺歩 骤如下1.样品预处理60%积雪草甙提取物用乙醇溶解，配置成浓度为40mg/ml的积雪草甙溶液，经0.45Mm微孔滤膜过滤。2. 色谱柱处理制备型高效液相柱是自己装填的制备柱，填料为粒径为10拜的C18 键合相填料，湿法装柱，色谱柱规格为50X250mm，以约10倍柱体积的洗 脱体系溶液平衡色谱柱。3. 上样将过滤后的样品溶液通过六通阀进样，进样体积为3ml。4. 洗脱流速控制在卯ml/min，在线207nm紫外检测，收集含有积雪草甙的洗 脱液，5. 积雪草甙化学对照品的获取减压浓縮积雪草甙洗脱液，浓縮温度控制在60'C。得到纯度为98.51% 的积雪草甙化学对照品。实施例3本实施例中，以60%的积雪草甙提取物为原料，以10nm的C18键合 相填料为吸附剂，以甲醇-水(60: 40，体积比)溶液为洗脱溶剂，具体工 艺步骤如下1. 样品预处理积雪草甙提取物用甲醇溶解，配置成浓度为40mg/ml的积雪草甙溶液， 经0.45阿微孔滤膜过滤。2. 色谱柱处理制备型高效液相柱是自己装填的制备柱，填料为粒径为10拜的C18 键合相填料，色谱柱规格为75X250mm，以约10倍柱体积的洗脱体系溶液 平衡色谱柱。3. 上样将过滤后的样品溶液通过六通阀进样，进样体积为10ml。 4 洗脱流速控制在150ml/min，在线200nm紫外检测，收集含有积雪草甙的洗 脱液，5'.积雪草甙化学对照品的获取减压浓縮积雪本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种积雪草甙化学对照品的分离制备方法，其特征在于：以重量含量３０～９７％的积雪草甙提取物为原料，以制备型高效液相色谱为分离手段，以甲醇－水溶液为洗脱体系，获得克级纯度９８％以上积雪草甙化学对照品；具体步骤为，（１）样品预处理：将重量含量３０～９７％的积雪草甙提取物用甲醇或乙醇溶液溶解，配置成重量浓度为３０～６０ｍｇ／ｍｌ的积雪草甙提取物溶液，经０．２２～０．４５μｍ微孔滤膜过滤；（２）色谱柱处理：高效液相色谱柱选择制备型高效液相色谱柱，以５～１０倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱；洗脱体系溶液为甲醇水溶液，其体积浓度为５０－８０％；（３）进样：将过滤后的样品溶液进样，进样体积为１～１００ｍｌ；（４）洗脱：采用洗脱体系溶液洗脱色谱柱，流速控制在１０～６００ｍｌ／ｍｉｎ，在线紫外监测，收集含有积雪草甙的洗脱液；（５）积雪草甙化学对照品的获得：减压浓缩所收集到的积雪草甙洗脱液至干，获得纯度高于９８％的积雪草甙化学对照品。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：肖红斌，高明哲，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：91[中国|大连]
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