鸡冠菜小孢子培养方法技术

本发明专利技术公开了一种鸡冠菜小孢子培养方法，包括以下步骤：摘取0.3～0.5cm大小的鸡冠菜花蕾，制备成小孢子悬浮液；将小孢子悬浮液利用诱导胚状体培养基培养获得胚状体，将胚状体利用植株再生培养基培养成试管苗，将试管苗切除周围愈伤组织后直接移入增殖培养基进行增殖培养，所得的丛生小苗Ⅱ重复上述增殖培养，从而实现继代增殖培养；将切除周围愈伤组织后的试管苗直接增殖培育成3.0～5.0cm高，然后转入生根培养基进行培育；或者将丛生小苗Ⅱ在增殖培养基中增殖培育成3.0～5.0cm高，割取单株小苗后转入生根培养基进行培育；待生根培养基上的苗长出3～5片叶子并形成根系后，得到可移栽植株。

Methods Jiguancai microspore culture

The invention discloses a method for culturing Jiguancai microspores, which comprises the following steps: the removal of 0.3 ~ 0.5cm size Jiguancai bud, prepared into microspore suspension; the microspore suspension by inducing embryoid cultured embryos to embryoid using plant regeneration culture substrate formed plantlets, the test tube seedling cut around the callus directly into proliferation medium were cultured, the overgrown seedlings II repeat the proliferation culture, so as to realize the subculture; the removal of plantlets around callus proliferation after directly bred 3 ~ 5.0cm, and then transferred to rooting medium to cultivate seedlings or cluster II; in the medium of proliferation developed into 3 ~ 5.0cm high proliferation, cut plant seedlings transferred to rooting medium for cultivation; to the rooting medium seedlings grow 3 After 5 leaves and roots, the transplanted plants can be obtained.

【技术实现步骤摘要】
鸡冠菜小孢子培养方法
本专利技术涉及鸡冠菜小孢子培养方法。
技术介绍
鸡冠菜是江浙一带的一个地方白菜类蔬菜品种，叶片边缘呈波浪形，多皱折，形状似鸡冠，故称鸡冠菜。鸡冠菜具有较高的营养价值，含有丰富的维生素和矿物质，炒食柔嫩多汁，以叶柄和叶片食用，经腌制加工后的雪菜色泽鲜黄、香气浓郁、滋味清脆鲜美，深受消费者欢迎。但鸡冠菜种质资源流失严重已濒于绝种，名、特、优蔬菜地方种质资源的收集保护工作不容忽视。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种鸡冠菜小孢子培养方法，采用该方法能获得大量的双单倍体。为了解决上述技术问题，本专利技术提供如下一种鸡冠菜小孢子培养方法，依次包括以下步骤：1)、从鸡冠菜主花序、一次分枝花序上摘取0.3～0.5cm大小的花蕾，置4±0.5℃冷藏(冰箱冷藏)72±2小时，然后将冷藏的花蕾取出后用水冲洗(放入纱布袋中用自来水冲洗半小时)；2)、取步骤1)所得的15～20枚水冲洗后的花蕾消毒、无菌水冲洗后，加入5ml的NLN培养液，挤压花蕾(用玻璃棒研碎挤压花蕾，目的是将小孢子挤出)，匀浆，过滤(40μm～50μm过滤器过滤去除花蕾表皮等碎片)，滤液离心(500～800r/min离心5min)，去上清液，在所得的沉淀中加入15ml～18mlNLN培养液；再重复上述过滤、滤液离心，去上清液；在第二次离心所得的沉淀中加8ml诱导胚状体培养基，得小孢子悬浮液；上述消毒可具体为：取步骤1)所得的15～20枚冲洗后的花蕾加入10ml质量浓度为5.0％～5.6％(体积％)次氯酸钠溶液，摇床(50～80r/min)消毒20分钟；所述无菌水冲洗的次数为3次；3)、取步骤2)所得小孢子悬浮液0.5ml于培养皿(6cm培养皿)中，加入3±0.5ml的诱导胚状体培养基(从而使培养皿底部被培养基盖满)，再加入0.2ml～0.3ml混合活性碳，混匀后密封培养皿置于32±1℃的恒温箱中黑暗培养72±2小时，之后移至25±1℃进行暗培养，当肉眼可见胚状体时，将培养皿移至摇床(45～50r/min)于25±1℃继续黑暗培养；所述混合活性碳的制备方法为：将1g的活性碳溶解于50±2ml诱导胚状体培养液中；4)、将步骤3)摇床培养15～20d后的胚状体(此时胚状体发育成鱼雷形状)移入植株再生培养基中，于25±1℃进行光培养，光照时间12h·d-1，光强为30～40μmol·m-2·s-1，培养3～4周后胚状体分化成试管苗；上述光照和暗培养交替进行；暗培养时的温度控制在22±1℃；5)、将步骤4)所得试管苗切除周围愈伤组织后直接移入增殖培养基中，继续25±1℃光培养，光照时间12h·d-1，光强为30～40μmol·m-2·s-1；上述光照和暗培养交替进行；暗培养时的温度控制在22±1℃；备注说明：1个胚状体再生为1个单株小苗，但小苗基部会有部分愈伤组织，如不去除愈伤组织会影响增殖效果；当增殖培养基中培养所得的小苗Ⅰ诱导出不定芽且小苗Ⅰ长到2.0～3.0cm高时(时间约30～35d)结束上述增殖培养，以2～3株不定芽为一丛进行割取作为丛生小苗Ⅱ；6)、以丛生小苗Ⅱ替代切除周围愈伤组织后的试管苗，重复上述步骤5)，从而实现继代增殖培养；7)、在步骤5)中，将切除周围愈伤组织后的试管苗直接增殖培育成3.0～5.0cm高，然后转入生根培养基进行培育；或者将丛生小苗Ⅱ在增殖培养基中增殖培育成3.0～5.0cm高(约需要一个月，培养条件同步骤5)，割取单株小苗后转入生根培养基进行培育；待生根培养基上的苗长出3～5片叶子并形成根系后(约20～25d)，得到可移栽植株；培养条件：25±1℃光培养，光照时间12h·d-1，光强为30～40μmol·m-2·s-1，光照和暗培养交替进行，暗培养时的温度控制在22±1℃。作为本专利技术的鸡冠菜小孢子培养方法的改进：将步骤7)所得的小植株移至基质培养钵中，浇(定期浇)水及营养液(常规营养液)；待小植株成活后移入温室驯化，以便逐渐适应大田条件；基质为泥炭：珍珠岩＝2:1的质量比。作为本专利技术的鸡冠菜小孢子培养方法的进一步改进：步骤2)、步骤3)诱导胚状体培养基为：改良NLN基础培养基+2,4-D0.02～0.05mg/L+蔗糖130g/L，pH为6.0。该诱导胚状体培养基的制作方法为：在1L的改良NLN基础培养基中加入2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)0.02～0.05mg、蔗糖130g均匀混合，利用1mol/L的KOH或1mol/L的HCl调节pH为6.0。作为本专利技术的鸡冠菜小孢子培养方法的进一步改进：步骤4)植株再生培养基为1/4MS基础培养基+蔗糖20g/L+琼脂粉8g/L，pH为5.8。该植株再生培养基的制作方法为：在1L的1/4MS(含1/4MS大量，全量的MS微量、铁盐和有机成份)中分别加入蔗糖20g、琼脂粉8g均匀混合，利用1mol/L的KOH或1mol/L的HCl调节pH为5.8。作为本专利技术的鸡冠菜小孢子培养方法的进一步改进：步骤5)、步骤6)增殖培养基为MS基础培养基+6-BA0.2～0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂粉8g/L，pH为5.8。该增殖培养基的制作方法为：在1L的MS基础培养基中分别加入6-苄基腺嘌呤(6-BA)0.2～0.5mg、蔗糖20g、琼脂粉8g均匀混合，利用1mol/L的KOH或1mol/L的HCl调节pH为5.8。作为本专利技术的鸡冠菜小孢子培养方法的进一步改进：步骤7)生根培养基为1/2MS基本培养基+蔗糖20g/L+琼脂粉8g/L，pH为5.8。生根培养基的制作方法为：在1L的1/2MS(含1/2MS大量，全量的MS微量、铁盐和有机成份)中分别加入蔗糖20g、琼脂粉8g均匀混合，利用1mol/L的KOH或1mol/L的HCl调节pH为5.8。在本专利技术中：改良NLN基础培养基为NLN基础培养基的大量元素、微量元素、有机成份+MS基础培养基的铁盐，即，具体如下表1所述(为常规配方)：表1、改良NLN基础培养基注：上述为每L改良NLN基础培养基的成分含量，余量为水。小孢子培养是指直接从花蕾或花药中获得小孢子群体进行培养的方法，由于小孢子培养较花药培养效率高，还可排除花药壁和绒毡层组织等体细胞的影响，因此受到育种学家的青睐，使用常规方法，选育一个纯合的自交系或自交不亲和系一般需要5～8年时间，而运用小孢子培养技术在1～2年就可以获得大量的双单培体植株，通过小孢子培养快速、有效地获得的纯系，可直接用于培育新品种或作为优良亲本间接应用于品种改良。从花药中分离获得的小孢子是单倍体又是单细胞，由于分离小孢子具有极强的胚胎发生能力和植株再生潜力，小孢子培养具有与单细胞微生物系统相似的所有优势，加倍后的双单倍体纯系通过筛选能获得目的突变性状，因而是突变诱导和突变体产生的理想途径。同时由于有大量的小孢子及胚体产生，增加了获得有益性状的机率，双单倍体的快速纯合，对多种性状的筛选能一步到位，提高了选择机率，也加快了育种进程。小孢子培养技术的应用可以加快提纯复壮与杂种纯合速度，创制新种质材料，为蔬菜品种的选育提供新的技术手段。尽管我国在芸苔属作物小孢子培养方面有较多研究，但对鸡冠菜的小孢子培养研究尚未见报导。综上所述，本专利技术建立的小孢子培养法，为地方蔬菜品种“鸡冠菜”的提纯复壮、创制本文档来自技高网...

【技术保护点】
鸡冠菜小孢子培养方法，其特征是依次包括以下步骤：1)、从鸡冠菜主花序、一次分枝花序上摘取0.3～0.5cm大小的花蕾，置4±0.5℃冷藏72±2小时，然后将冷藏的花蕾取出后用水冲洗；2)、取步骤1)所得的15～20枚水冲洗后的花蕾消毒、无菌水冲洗后，加入5ml的NLN培养液，挤压花蕾，匀浆，过滤，滤液离心，去上清液，在所得的沉淀中加入15ml～18ml NLN培养液；再重复上述过滤、滤液离心，去上清液；在第二次离心所得的沉淀中加8ml诱导胚状体培养基，得小孢子悬浮液；3)、取步骤2)所得小孢子悬浮液0.5ml于培养皿中，加入3±0.5ml的诱导胚状体培养基，再加入0.2ml～0.3ml混合活性碳，混匀后密封培养皿置于32±1℃的恒温箱中黑暗培养72±2小时，之后移至25±1℃进行暗培养，当肉眼可见胚状体时，将培养皿移至摇床于25±1℃继续黑暗培养；所述混合活性碳的制备方法为：将1g的活性碳溶解于50±2ml诱导胚状体培养液中；4)、将步骤3)摇床培养15～20d后的胚状体移入植株再生培养基中，于25±1℃进行光培养，光照时间12h·d

【技术特征摘要】
1.鸡冠菜小孢子培养方法，其特征是依次包括以下步骤：1)、从鸡冠菜主花序、一次分枝花序上摘取0.3～0.5cm大小的花蕾，置4±0.5℃冷藏72±2小时，然后将冷藏的花蕾取出后用水冲洗；2)、取步骤1)所得的15～20枚水冲洗后的花蕾消毒、无菌水冲洗后，加入5ml的NLN培养液，挤压花蕾，匀浆，过滤，滤液离心，去上清液，在所得的沉淀中加入15ml～18mlNLN培养液；再重复上述过滤、滤液离心，去上清液；在第二次离心所得的沉淀中加8ml诱导胚状体培养基，得小孢子悬浮液；3)、取步骤2)所得小孢子悬浮液0.5ml于培养皿中，加入3±0.5ml的诱导胚状体培养基，再加入0.2ml～0.3ml混合活性碳，混匀后密封培养皿置于32±1℃的恒温箱中黑暗培养72±2小时，之后移至25±1℃进行暗培养，当肉眼可见胚状体时，将培养皿移至摇床于25±1℃继续黑暗培养；所述混合活性碳的制备方法为：将1g的活性碳溶解于50±2ml诱导胚状体培养液中；4)、将步骤3)摇床培养15～20d后的胚状体移入植株再生培养基中，于25±1℃进行光培养，光照时间12h·d-1，光强为30～40μmol·m-2·s-1，培养3～4周后胚状体分化成试管苗；上述光照和暗培养交替进行；暗培养时的温度控制在22±1℃；5)、将步骤4)所得试管苗切除周围愈伤组织后直接移入增殖培养基中，继续25±1℃光培养，光照时间12h·d-1，光强为30～40μmol·m-2·s-1；上述光照和暗培养交替进行；暗培养时的温度控制在22±1℃；当增殖培养基中培养所得的小苗Ⅰ诱导出不定芽且小苗Ⅰ长到2.0～3.0cm高时结束上述增殖培养，以2～3株不...

【专利技术属性】
技术研发人员：王淑珍，柴伟国，阮松林，
申请(专利权)人：杭州市农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：浙江,33