糖修饰的缺口寡核苷酸制造技术

本发明专利技术提供了一些寡核苷酸，这些寡核苷酸具有增加的核酸酶抗性，具有增加对互补核酸链的结合亲和性的取代基，并且具有激活ＲＮａｓｅＨ的２’－脱氧－赤型－呋喃戊糖基核苷的亚序列。这些寡核苷酸在诊断学和其它目的的研究中，在调节蛋白质在有机体中的表达上，和在诊断、检测与治疗对寡核苷酸治疗敏感的其它疾病上是有用的。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用于激发RNase H活性(用于相反链中的链切割)的寡核苷酸的合成方法和用途。包括在本专利技术中的是这样一些寡核苷酸，其中所说寡核苷酸的至少一些核苷单位是核酸酶抗性功能化的，所说寡核苷酸的至少一些核苷单位包括加强寡核苷酸与核酸互补链杂交的取代基，以及所说寡核苷酸的至少一些核苷单位包括2’-脱氧-赤型-呋喃戊糖基(pentofuranosyl)糖组分。所说的寡核苷酸可用于治疗学、诊断学和作为研究试剂。
技术介绍
已知寡核苷酸与单链的DNA或者RNA分子杂交。杂交是寡核苷酸的核碱基(nucleobase)与靶DNA或者RNA的核碱基的序列特异性碱基对氢键结合。一般认为这样的核碱基对是相互互补的。在测定寡核苷酸与互补核酸的杂交程度时，通过测定特定的杂交复合体的解链温度，可以比较寡核苷酸与互补核酸结合的相对能力。作为双螺旋的一个特征物理性质，解链温度(Tm)表示当50％螺旋(杂交的)-卷曲(未杂交的)形式出现时的温度(摄氏度)。通过利用紫外光谱测定杂交复合体的形成和断裂(解链)来测量Tm。在杂交期间发生的碱基堆积伴随着紫外吸收的减弱(减色性)。因而，紫外吸收的减弱表明更高的Tm。Tm越高，链之间的键强度越大。通过利用胞内酶RNase H，寡核苷酸可以用来实现靶RNA的酶促切割。一般认为这样的RNase H切割的机理要求2’-脱氧呋喃核糖基寡核苷酸与靶RNA杂交。所产生的DNA-RNA双螺旋激活RNase H酶，并且该活化的酶切割RNA链。RNA链的切割破坏了RNA的正常功能。一般认为硫代磷酸寡核苷酸经由这类机理操纵。然而，对于有用于RNase H的细胞活化的DNA寡核苷酸来说，优选地，寡核苷酸对核酸酶是相当稳定的以便在细胞中存活足以使RNase H活化的一段时间。对于非细胞用途(如作为研究试剂的寡核苷酸用途)来说，这样的核酸酶稳定性可以是不必要的。数种出版物描述了RNase H和寡核苷酸的相互作用。尤其感兴趣的是(1)Dagle等，核酸研究，1990,18,4751；(2)Dagle等，反义研究与发展，1991,1,11；(3)Eder等，生物化学杂志，1991,266,6472；以及(4)Dagle等，核酸研究，1991,19,1805。按照这些出版物，既具有未修饰磷酸二酯核苷间键合也具有修饰硫代磷酸酯核苷间键合的DNA寡核苷酸是细胞RNase H的底物。由于它们是底物，因此它们激活靶RNA的RNase H切割。然而，作者还注意到在非洲蟾蜍属胚胎中，磷酸二酯键合以及硫代磷酸酯键合都易于为外切核酸酶降解。这样的核酸酶降解是有害的，因为它迅速耗尽可供RNase H活化使用的寡核苷酸。如参考文献(1)、(2)和(4)中所描述的，为了使抗核酸酶降解的寡核苷酸稳定而又能提供RNase H活化作用，人们构建了具有短区段的磷酸二酯键合核苷(位于氨基磷酸酯、烷基膦酸酯或者磷酸三酯键合的区段之间)的2’-脱氧寡核苷酸。当使包含氨基磷酸酯的寡核苷酸抗外切核酸酶稳定时，在参考文献(4)中作者特别提到每一种氨基磷酸酯键合在包含氨基磷酸酯的寡核苷酸的Tm测量值方面导致1.6℃的损失。在Tm值方面的这种减少表明在寡核苷酸和其靶链之间的杂交方面的减少。其它作者曾评论了在寡核苷酸和其靶链之间的杂交的这种损失所可能有的影响。Saison-Behmoaras等(EMBO杂志，1991,10,1111)观察到尽管寡核苷酸可以是RNase H的底物，但是由于寡核苷酸与mRNA之间的弱杂交，RNase H的切割效率是低的。作者也注意到在寡核苷酸的3’末端包含的吖啶取代保护了寡核苷酸免受外切核酸酶的影响。美国专利5,013,830(1991年5月7日颁发)揭示了包含RNA寡聚体或者其衍生物的混合寡聚体，该混合寡聚体经由磷酸二酯键合与DNA寡聚体连结。RNA寡聚体也携带2’-O-烷基取代基。然而，正是由于磷酸二酯，使得寡聚体对核酸酶切割敏感。欧洲专利申请339,842(1989年4月13日递交)揭示了包括2’-O-甲基核糖寡核苷酸硫代磷酸酯衍生物的2’-O-取代的硫代磷酸酯寡核苷酸。上述申请也揭示了缺乏核酸酶抗性的2’-O-甲基磷酸二酯寡核苷酸。美国专利5,149,797(1992年9月22日颁发)揭示了混合的磷酸酯主链寡核苷酸，其包括为磷酸二酯键所结合的、并为一部分修饰DNA或者RNA序列在每一侧面上侧结合的脱氧核苷酸的内部部分。侧翼序列包括膦酸甲酯、吗啉磷酸酯(phosphoromorpholidate)、哌嗪磷酸酯(phosphoropiperazidate)或者氨基磷酸酯键。美国专利5,256,775(1993年10月26日颁发)描述了掺入氨基磷酸酯键和硫代磷酸酯或者二硫代磷酸酯键的混合寡核苷酸。当人们认识到靶RNA链的切割(利用寡核苷酸和RNase H)将是有用的时候，寡核苷酸的核酸酶抗性和杂交的保真性在寡核苷酸治疗学的发展中是十分重要的。因此，长期以来一直感到需要一些方法和材料，当同时保持或者改进杂交性质并提供核酸酶抗性时，这些方法和材料能够激活RNase H。这样的寡核苷酸也要求作为研究试剂和诊断试剂。专利技术概要按照本专利技术的一个实施方案，本专利技术提供了由核苷单位的序列形成的寡核苷酸。该寡核苷酸掺入增加寡核苷酸的核酸酶抗性的功能化的至少一个核苷单位。此外，寡核苷酸的至少一些核苷单位是用取代基功能化的，以增加寡核苷酸与靶核糖核酸的结合亲和性，同时至少一些核苷单位具有2’-脱氧-赤型-呋喃戊糖基糖组分。在本专利技术的优选的寡核苷酸中，增加结合亲和性功能化的核苷单位包括2’-取代基。在优选的实施方案中，2’-取代基包括氟基、C1-C20烷氧基、C1-C9氨基烷氧基(包括氨基丙氧基)、烯丙氧基、咪唑烷氧基和聚乙二醇。优选的烷氧基取代基包括甲氧基、乙氧基和丙氧基。一个优选的氨基烷氧基单位是氨基丙氧基。一个优选的咪唑烷氧基取代基是咪唑丙氧基。一个优选的聚乙二醇取代基是-O-乙基-O-甲基或者甲氧基乙氧基(-O-CH2-CH2-O-CH3)。本专利技术的寡核苷酸包括由带电磷键(选自由磷酸二酯和硫代磷酸酯键组成的组中)连接的核苷单位。本专利技术的寡核苷酸包括许多携带取代基(增加寡核苷酸与核酸的互补链的结合亲和性)的结合核苷单位。在某些优选的实施方案中，具有携带这样的取代基的核苷单位的寡核苷酸序列可以划分成第一亚序列和第二亚序列，其中第一亚序列具有携带2’-取代-赤型-呋喃戊糖基糖组分的结合核苷单位而第二亚序列具有携带2’-脱氧-赤型-呋喃戊糖基糖组分的结合核苷单位。优选地，所说的第二亚序列具有至少三个核苷单位，更优选地，具有至少五个核苷单位。在其它优选的实施方案中有第三亚序列，其中的核苷单位选自那些可由第一亚序列选择的核苷单位。优选的是，第二亚序列位于第一和第三亚序列之间。本专利技术的这样的寡核苷酸也称作“嵌合体”或者“嵌合的”或“有缺口的”寡核苷酸。在本专利技术的其它优选寡核苷酸中，携带增加结合亲和性的取代基的核苷单位位于寡核苷酸的一或两个3’或5’末端。可以有一个至大约八个为取代基取代的核苷单位。优选地，至少五个核苷单位携带2’-脱氧-赤型-呋喃戊糖基糖组分。本专利技术的寡核苷酸的核苷单位包含由磷键(如磷酸二酯和硫代磷酸酯键)与2’-取代和2’-脱氧-赤本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可特异地与包含以共价键结合的核苷单位的线型序列的ＤＮＡ或者ＲＮＡ杂交的寡核苷酸，其中：所说的序列包含具有２’－Ｏ－ＣＨ↓［２］－ＣＨ↓［２］－Ｏ－ＣＨ↓［２］糖组分的第一核苷亚序列和具有２’－脱氧糖组分的第二核苷亚序列；并且所说 的第一和第二亚序列的核苷单位是由磷酸二酯或者硫代磷酸酯键共价结合的。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：PD库克，B莫尼亚，KH奥特曼，P马丁，
申请(专利权)人：伊希斯药物有限公司，诺瓦提斯公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]