制备用于测序的核酸的方法技术

本文所公开的技术的方面涉及用于制备和分析核酸的方法。在一些实施方式中，本文提供了制备用于序列分析(例如，使用下一代测序)的核酸的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】制备用于测序的核酸的方法相关申请根据35U.S.C.§119，本申请要求2014年1月27日提交的美国临时申请U.S.61/931,959的权益，以引用的方式将其整体内容并入本文。
本文所述的技术涉及制备和分析核酸的方法。
技术介绍
相比全基因组、全外显子组以及全转录组测序，下一代测序(next-generationsequencing)前的靶富集更具成本效益，因此更适于在研究发现和临床应用中广泛实施。例如，由靶富集方法提供的高覆盖深度(highcoveragedepth)能够实现较宽动态范围的等位基因计数(在基因表达和拷贝数评估中)以及对低频突变的检测(用于评价癌症中的体细胞突变的关键特征)。目前用于下一代测序的富集方案的实例包括：基于杂交的捕获分析(TruSeqCapture，Illumina；SureSelectHybridCapture，Agilent)和基于聚合酶链式反应(PCR)的分析(HaloPlex，Agilent；AmpliSeq，IonTorrent；TruSeq扩增子，Illumina；乳液/数字PCR，Raindance)。基于杂交的方法不仅捕获到被捕获探针覆盖的靶向序列，还捕获到了消耗测序能力的附近的脱靶碱基(nearoff-targetbases)。此外，这些方法都比较费时、劳动密集、并且特异性水平较低。
技术实现思路
本文所公开的技术的方面涉及用于制备和分析核酸的方法。在一些实施方式中，本文提供了制备用于序列分析(例如，使用下一代测序)的核酸的方法。在一些实施方式中，本文所述的技术针对确定核酸的核苷酸序列的方法。在一些实施方式中，本文所公开的方法涉及在测序前对靶核酸进行富集。本文所公开的技术的方面涉及确定与已知的靶核苷酸序列邻近(contiguousto)的核苷酸序列的方法。在一些实施方式中，所述方法涉及：(a)在杂交条件下，使包含已知的靶核苷酸序列的靶核酸分子与起始靶特异性引物接触；(b)进行模板依赖性延伸反应，所述反应通过杂交的起始靶特异性引物启动并使用靶核酸分子作为模板；(c)在杂交条件下，使步骤(b)的产物与加尾随机引物群接触；(d)进行模板依赖性延伸反应，所述反应通过杂交的加尾随机引物启动并使用杂交位点下游的靶核酸分子的一部分作为模板；(e)用第一尾引物和第一靶特异性引物对加尾随机引物序列和靶核酸分子的一部分进行扩增；(f)用第二尾引物和第二靶特异性引物对步骤(e)产生的扩增子的一部分进行扩增；以及(g)使用第一测序引物和第二测序引物对来自步骤(f)的扩增部分进行测序。在一些实施方式中，加尾随机引物群包括单链寡核苷酸分子，所述单链寡核苷酸分子具有与第一测序引物相同的5’核酸序列和含有约6个-约12个随机核苷酸的3’核酸序列。在一些实施方式中，第一靶特异性引物包含如下核酸序列，所述核酸序列能够在退火温度下特异性地退火至靶核酸的已知的靶核苷酸序列。在一些实施方式中，第二靶特异性引物包含3’部分和5’部分，所述3’部分包含能够特异性地退火至由步骤(e)产生的扩增子所包含的已知的靶核苷酸序列的一部分的核酸序列，所述5’部分包含与第二测序引物相同的核酸序列，且第二靶特异性引物相对于第一靶特异性引物嵌套(nested)。在一些实施方式中，第一尾引物包含与加尾随机引物相同的核酸序列。在一些实施方式中，第二尾引物包含与第一测序引物的一部分相同的核酸序列，并且第二尾引物相对于第一尾引物嵌套。在一些实施方式中，所述方法涉及：(a)在杂交条件下，使包含已知的靶核苷酸序列的靶核酸分子与加尾随机引物群接触；(b)进行模板依赖性延伸反应，所述反应通过杂交的加尾随机引物启动并使用杂交位点下游的靶核酸分子的部分作为模板；(c)在杂交条件下，使步骤(b)的产物与起始靶特异性引物接触；(d)进行模板依赖性延伸反应，所述反应通过杂交的起始靶特异性引物启动并使用靶核酸分子作为模板；(e)用第一尾引物和第一靶特异性引物对加尾随机引物序列和靶核酸分子的一部分进行扩增；(f)用第二尾引物和第二靶特异性引物对步骤(e)产生的扩增子的一部分进行扩增；以及(g)使用第一测序引物和第二测序引物对来自步骤(f)的扩增部分进行测序。在一些实施方式中，加尾随机引物群包括单链寡核苷酸分子，所述单链寡核苷酸分子具有与第一测序引物相同的5’核酸序列和含有约6个-约12个随机核苷酸的3’核酸序列。在一些实施方式中，第一靶特异性引物包含如下核酸序列，所述核酸序列能够在退火温度下特异性地退火至靶核酸的已知的靶核苷酸序列。在一些实施方式中，第二靶特异性引物包含3’部分和5’部分，所述3’部分包含能够特异性地退火至由步骤(c)产生的扩增子所包含的已知的靶核苷酸序列的一部分的核酸序列，所述5’部分包含与第二测序引物相同的核酸序列，且第二靶特异性引物相对于第一靶特异性引物嵌套。在一些实施方式中，第一尾引物包含与加尾随机引物相同的核酸序列。在一些实施方式中，第二尾引物包含与第一测序引物的一部分相同的核酸序列，并且第二尾引物相对于第一尾引物嵌套。在一些实施方式中，所述方法进一步涉及在起始靶特异性引物的延伸之后，使样品和/或产物与RNase接触的步骤。在一些实施方式中，加尾随机引物可形成发夹环结构。在一些实施方式中，起始靶特异性引物和第一靶特异性引物相同。在一些实施方式中，在与第一测序引物相同的5’核酸序列和含有6个-12个随机核苷酸的3’核酸序列之间，加尾随机引物进一步包含含有6个-12个随机核苷酸的条形码(barcode)部分。在一些实施方式中，所述方法涉及：(a)在杂交条件下，使包含已知的靶核苷酸序列的靶核酸分子与加尾随机引物群接触；(b)进行模板依赖性延伸反应，所述反应通过杂交的加尾随机引物启动并使用杂交位点下游的靶核酸分子的部分作为模板；(c)用第一尾引物和第一靶特异性引物对加尾随机引物序列和靶核酸分子的一部分进行扩增；(d)用第二尾引物和第二靶特异性引物对步骤(c)产生的扩增子的一部分进行扩增；以及(e)使用第一测序引物和第二测序引物对来自步骤(d)的扩增部分进行测序。在一些实施方式中，加尾随机引物群包括单链寡核苷酸分子，所述单链寡核苷酸分子具有与第一测序引物相同的5’核酸序列、含有6个-12个随机核苷酸的中间的条形码部分以及含有约6个-约12个随机核苷酸的3’核酸序列。在一些实施方式中，第一靶特异性引物包含如下核酸序列，所述核酸序列能够在退火温度下特异性地退火至靶核酸的已知的靶核苷酸序列。在一些实施方式中，第二靶特异性引物包含3’部分和5’部分，所述3’部分包含能够特异性地退火至由步骤(c)产生的扩增子所包含的已知的靶核苷酸序列的一部分的核酸序列，所述5’部分包含与第二测序引物相同的核酸序列，且第二靶特异性引物相对于第一靶特异性引物嵌套。在一些实施方式中，第一尾引物包含与加尾随机引物相同的核酸序列。在一些实施方式中，第二尾引物包含与第一测序引物的一部分相同的核酸序列，并且第二尾引物相对于第一尾引物嵌套。在一些实施方式中，在与第一测序引物相同的5’核酸序列和含有约6个-约12个随机核苷酸的3’核酸序列之间，各加尾随机引物进一步包含间隔区核酸序列。在特定的实施方式中，在延伸步骤之后，将未杂交的引物从反应中移除。在一些实施方式中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备用于分析的核酸的方法，所述方法包括：(a)在促进模板特异性杂交和靶特异性引物的延伸的条件下，使包含靶核酸的第一链的核酸模板与包含靶特异性杂交序列的互补的靶特异性引物接触；以及(b)在促进模板特异性杂交和多个不同引物的至少一个的延伸的条件下，使包含与所述靶核酸的第一链互补的第二链的核酸模板与共享如下共同序列的多个不同引物接触，所述共同序列为不同杂交序列的5’端；其中，产生延伸产物，所述延伸产物同时包含具有所述靶特异性引物特征的序列和具有所述多个不同引物的至少一个的特征的序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.01.27 US 61/931,9591.一种制备用于分析的核酸的方法，所述方法包括：(a)在促进模板特异性杂交和靶特异性引物的延伸的条件下，使包含靶核酸的第一链的核酸模板与包含靶特异性杂交序列的互补的靶特异性引物接触；以及(b)在促进模板特异性杂交和多个不同引物的至少一个的延伸的条件下，使包含与所述靶核酸的第一链互补的第二链的核酸模板与共享如下共同序列的多个不同引物接触，所述共同序列为不同杂交序列的5’端；其中，产生延伸产物，所述延伸产物同时包含具有所述靶特异性引物特征的序列和具有所述多个不同引物的至少一个的特征的序列。2.如权利要求1所述的方法，其中，所述靶核酸是核糖核酸。3.如权利要求1所述的方法，其中，所述靶核酸是脱氧核糖核酸。4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，顺序进行步骤(a)和步骤(b)。5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，步骤(a)中的所述核酸模板包含从步骤(b)中的所述多个不同引物的至少一个的延伸和杂交产生的延伸产物。6.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，步骤(b)中的所述核酸模板包含从步骤(a)中的所述靶特异性引物的延伸和杂交产生的延伸产物。7.如权利要求2所述的方法，其中，所述靶核酸是编码自包含基因重排的染色体片段的信使RNA。8.如权利要求3所述的方法，其中，所述靶核酸是包含基因重排的一部分的染色体片段。9.如权利要求8所述的方法，其中，所述基因重排是倒位、缺失或易位。10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，所述方法进一步包括对所述延伸产物进行扩增。11.如权利要求1-9中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在杂交发生在所述延伸产物和固定的寡核苷酸之间的条件下，使所述延伸产物或扩增的延伸产物与固定的寡核苷酸接触。12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述靶核酸包含具有已知序列的靶部分和具有未知序列的侧翼部分。13.如权利要求12所述的方法，其中，不同的杂交序列与所述侧翼部分互补。14.如权利要求12或13所述的方法，其中，所述靶特异性杂交序列与所述靶部分互补。15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中，所述靶特异性引物进一步包含：所述靶特异性杂交序列的5’端；条形码序列、接头序列和索引序列的至少一个。16.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中，所述共同序列包括条形码序列、接头序列和索引序列的至少一个。17.如权利要求15或16所述的方法，其中，所述接头序列是在流通池中用于固定寡核苷酸的可切割的接头序列。18.一种确定与已知的靶核苷酸序列邻近的核苷酸序列的方法，所述方法包括：(a)在杂交条件下，使包含所述已知的靶核苷酸序列的靶核酸分子与起始靶特异性引物接触；(b)进行模板依赖性延伸反应，所述反应通过杂交的起始靶特异性引物启动并使用所述靶核酸分子作为模板；(c)在杂交条件下，使步骤(b)的产物与加尾随机引物群接触；(d)进行模板依赖性延伸反应，所述反应通过杂交的加尾随机引物启动并使用杂交位点下游的所述靶核酸分子的一部分作为模板；(e)用第一尾引物和第一靶特异性引物对所述靶核酸分子的一部分和加尾随机引物序列进行扩增；(f)用第二尾引物和第二靶特异性引物对步骤(e)产生的扩增子的一部分进行扩增；(g)使用第一测序引物和第二测序引物对来自步骤(f)的扩增部分进行测序；其中，所述加尾随机引物群包括单链寡核苷酸分子，所述单链寡核苷酸分子具有与第一测序引物相同的5’核酸序列以及含有约6个-约12个随机核苷酸的3’核酸序列；其中，所述第一靶特异性引物包含核酸序列，所述核酸序列在退火温度下能够特异性地退火至所述靶核酸的所述已知的靶核苷酸序列；其中，所述第二靶特异性引物包含3’部分和5’部分，所述3’部分包含能够特异性地退火至由步骤(e)产生的扩增子所包含的所述已知的靶核苷酸序列的一部分的核酸序列，所述5’部分包含与第二测序引物相同的核酸序列，且所述第二靶特异性引物相对于所述第一靶特异性引物嵌套；其中，所述第一尾引物包含与所述加尾随机引物相同的核酸序列；以及其中，所述第二尾引物包含与所述第一测序引物的一部分相同的核酸序列，并且所述第二尾引物相对于所述第一尾引物嵌套。19.一种确定与已知的靶核苷酸序列邻近的核苷酸序列的方法，所述方法包括：(a)在杂交条件下，使包含所述已知的靶核苷酸序列的靶核酸分子与加尾随机引物群接触；(b)进行模板依赖性延伸反应，所述反应通过杂交的加尾随机引物启动并使用杂交位点下游的所述靶核酸分子的一部分作为模板；(c)在杂交条件下，使所述步骤(b)的产物与起始靶特异性引物接触；(d)进行模板依赖性延伸反应，所述反应通过杂交的起始靶特异性引物启动并使用所述靶核酸分子作为模板；(e)用第一尾引物和第一靶特异性引物对所述靶核酸分子的一部分和加尾随机引物序列进行扩增；(f)用第二尾引物和第二靶特异性引物对步骤(e)产生的扩增子的一部分进行扩增；(g)使用第一测序引物和第二测序引物对来自步骤(f)的扩增部分进行测序；其中，所述加尾随机引物群包括单链寡核苷酸分子，所述单链寡核苷酸分子具有与第一测序引物相同的5’核酸序列以及含有约6个-约12个随机核苷酸的3’核酸序列；其中，所述第一靶特异性引物包含核酸序列，所述核酸序列在退火温度下能够特异性地退火至所述靶核酸的所述已知的靶核苷酸序列；其中，所述第二靶特异性引物包含3’部分和5’部分，所述3’部分包含能够特异性地退火至由步骤(c)产生的扩增子所包含的所述已知的靶核苷酸序列的一部分的核酸序列，所述5’部分包含与第二测序引物相同的核酸序列，且所述第二靶特异性引物相对于所述第一靶特异性引物嵌套；其中，所述第一尾引物包含与所述加尾随机引物相同的核酸序列；以及其中，所述第二尾引物包含与所述第一测序引物的一部分相同的核酸序列，并且所述第二尾引物相对于所述第一尾引物嵌套。20.如权利要求18-19中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在所述起始靶特异性引物的延伸之后，使所述样品和产物与RNase接触的步骤。21.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述加尾随机引物可形成发夹环结构。22.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述起始靶特异性引物和所述第一靶特异性引物相同。23.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，在与第一测序引物相同的所述5’核酸序列和含有6个-12个随机核苷酸的所述3’核酸序列之间，所述加尾随机引物进一步包含含有6个-12个随机核苷酸的条形码部分。7.一种确定与已知的靶核苷酸序列邻近的核苷酸序列的方法，所述方法包括：(a)在杂交条件下，使包含所述已知的靶核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾森·迈尔斯，乔舒亚·斯托尔，安东尼·约翰·亚弗拉特，李龙飞，郑宗立，
申请(专利权)人：通用医疗公司，阿彻迪克有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US