氧化稳定的α‑淀粉酶变体制造技术

本发明专利技术涉及氧化稳定的α‑淀粉酶变体。本发明专利技术还涉及编码这些变体的多核苷酸；包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞；以及使用这些变体的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】氧化稳定的α-淀粉酶变体对序列表的引用本申请包括计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。专利技术背景专利
本专利技术涉及氧化稳定的α-淀粉酶变体、编码这些变体的多核苷酸、产生这些变体的方法、以及使用这些变体的方法。相关领域描述α-淀粉酶(α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)构成一组酶，这些酶催化淀粉以及其他直链和支链1,4-糖苷寡糖和多糖的水解。α-淀粉酶是用于洗涤剂组合物中的关键酶并且对于衣物洗涤或餐具洗涤期间去除淀粉污渍，其用途已经变得日益重要。一些洗涤剂，特别是餐具洗涤剂，包括漂白系统、漂白活化剂、和漂白催化剂，由于这些分子的氧化，这些洗涤剂对于α-淀粉酶都是不稳定的。因此，重要的是找到如下α-淀粉酶变体，这些变体在包含多种漂白剂的洗涤剂中是稳定的、具有高的洗涤性能、污渍去除作用和/或活性。在本领域中已知的是，通过用，例如亮氨酸，取代在位置197(使用来自地衣芽孢杆菌的淀粉酶用于编号)处的甲硫氨酸，来稳定对于漂白剂和氧化的α-淀粉酶。例如这已经披露于WO199418314中。然而，这些现有技术中氧化稳定的α-淀粉酶具有以下缺点：该α-淀粉酶活性降低。因此，本专利技术的目的在于提供α-淀粉酶变体，与其亲本α-淀粉酶相比，这些变体在洗涤剂(特别是在餐具洗涤剂和其他包括漂白剂或漂白系统的洗涤剂)中展示出高水平的稳定性，但同时具有改进的洗涤性能。另外的目的是提供如下α-淀粉酶变体，这些变体具有高性能(特别是高洗涤性能，特别是高餐具洗涤性能)。本专利技术提供了如下α-淀粉酶变体，这些变体，与其亲本相比具有改进的稳定性，并且与其亲本相比具有改进的活性。专利技术概述本专利技术涉及亲本α-淀粉酶的α-淀粉酶变体，其中该变体在提供该变体的氧化稳定性的一个或多个位置处包含取代，其中当与其亲本α-淀粉酶相比，该变体的改进系数>1.0，并且其中该变体具有α-淀粉酶活性。本专利技术还涉及包含根据本专利技术所述的变体的组合物。另外，本专利技术还涉及编码这些变体的多核苷酸，包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞，以及生产这些变体的方法。变体命名规则出于本专利技术的目的，使用如在SEQIDNO：3中阐述的氨基酸序列来确定另一种α-淀粉酶中的相应的氨基酸残基。将另一种α-淀粉酶的氨基酸序列与SEQIDNO：3中阐述的氨基酸序列进行比对，并且基于该比对，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(TrendsGenet.)16：276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48：443-453)来确定与SEQIDNO：3中所阐述的氨基酸序列中的任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。可以通过使用若干计算机程序，使用其对应默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种α-淀粉酶中的对应氨基酸残基的鉴定，所述计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数-预期的多种序列比较；版本3.5或更新版本；埃德加(Edgar)，2004，核酸研究(NucleicAcidsResearch)32：1792-1797)、MAFFT(版本6.857或更新版本；加藤(Katoh)和库马(Kuma)，2002，核酸研究30：3059-3066；加藤等人，2005，核酸研究33：511-518；加藤和都(Toh)，2007，生物信息学(Bioinformatics)23：372-374；加藤等人，2009，分子生物学方法(MethodsinMolecularBiology)537：39-64；加藤和都，2010，生物信息学26：1899-1900)以及采用ClustalW(1.83或更新版本；汤姆斯(Thompson)等人，1994，核酸研究22：4673-4680)的EMBOSSEMMA。当其他酶与SEQIDNO：3中阐述的氨基酸序列相背离使得传统的基于序列的比较方法不能检测其相互关系时(林达尔(Lindahl)和埃洛弗松(Elofsson)，2000，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)295：613-615)，可使用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中的更大灵敏度可以使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表示(特征曲线)来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(阿特休尔(Atschul)等人，1997，《核酸研究》25：3389-3402)。如果多肽的家族或超家族在蛋白结构数据库中具有一个或多个代表，则可以实现甚至更大的灵敏度。程序如GenTHREADER(琼斯(Jones)，1999，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)287：797-815；麦古芬(McGuffin)和琼斯，2003，生物信息学(Bioinformatics)19：874-881)利用来自不同来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，高夫(Gough)等人，2000，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)313：903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评定此类模型的准确度。对于已知结构的蛋白，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问的并且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵(奥尔姆(Holm)和桑德(Sander)，1998，蛋白质(Proteins)33：88-96)或组合延伸(辛迪亚洛夫(Shindyalov)和伯恩(Bourne)，1998，蛋白质工程(ProteinEngineering)11：739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，奥尔姆和帕克(Park)，2000，生物信息学(Bioinformatics)16：566-567)。在描述本专利技术的变体中，以下所述的命名法适于方便参考。使用公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。取代.对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、取代的氨基酸。因此，将在位置226处的苏氨酸与丙氨酸的置换命名为“Thr226Ala”或“T226A”。多个突变由加号(“+”)分隔，例如，“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”，代表在位置205和411分别将甘氨酸(G)置换为精氨酸(R)，并且将丝氨酸(S)置换为苯丙氨酸(F)。缺失.对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、*。因此，在位置195处的甘氨酸的缺失命名为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失由加号(“+”)分隔，例如，“Gly195*本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种亲本α‑淀粉酶的α‑淀粉酶变体，其中所述变体在提供所述变体的氧化稳定性的一个或多个位置处包含取代，其中当与所述亲本α‑淀粉酶相比，所述变体的改进系数>1.0，该系数作为洗涤性能的量度，并且其中所述变体具有α‑淀粉酶活性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.05.08 EP 15166870.4;2014.06.12 US 62/011,5641.一种亲本α-淀粉酶的α-淀粉酶变体，其中所述变体在提供所述变体的氧化稳定性的一个或多个位置处包含取代，其中当与所述亲本α-淀粉酶相比，所述变体的改进系数>1.0，该系数作为洗涤性能的量度，并且其中所述变体具有α-淀粉酶活性。2.根据权利要求1所述的变体，其中所述氧化稳定性是通过自动机械应力测定法(AMSA)确定的，其中所述变体在55℃下试验20分钟，并且其中在所述AMSA中使用的洗涤剂包括如实例3中所述的漂白系统。3.根据以上权利要求中任一项所述的变体，其中所述漂白体系以如下浓度添加：至少5重量％，例如至少8重量％、例如至少10重量％、或例如至少15重量％。4.根据以上权利要求中任一项所述的变体，其中所述亲本α-淀粉酶具有SEQIDNO：3中阐述的氨基酸序列，或具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQIDNO：3中阐述的氨基酸序列具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少98％一致性。5.根据以上权利要求中任一项所述的变体，其中所述亲本α-淀粉酶包括SEQIDNO：3中所阐述的氨基酸序列或由其组成。6.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中所述亲本α-淀粉酶是SEQIDNO：3的多肽的片段，其中该片段具有α-淀粉酶活性。7.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中所述变体与SEQIDNO：3中阐述的氨基酸序列具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少98％、但少于100％序列一致性。8.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中所述变体在位置202处包含取代，其中所述位置对应于SEQIDNO：3中阐述的氨基酸序列的氨基酸位置。9.根据权利要求8所述的变体，其中所述的在位置202中的取代选自以下各项中任一项：M202A、M202R、M202N、M202D、M202C、M202E、M202Q、M202G、M202H、M202I、M202L、M202K、M202F、M202P、M202S、M202T、M202W、M202Y和M202V，优选地M202L、M202I、M202T、M202F和M202S，其中所述位置对应于阐述于SEQIDNO：3中的氨基酸序列中的位置。10.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述变体包含在如下两个或更多个位置的缺失，这些位置对应于阐述于SEQIDNO：3中的氨基酸序列的位置R181、G182、D183、和G184。11.根据权利要求10所述的变体，其中所述变体在对应于R181+G182；R181+D183；R181+G184；G182+D183；G182...

【专利技术属性】
技术研发人员：C安德森，AD霍格，SE拉森，A法拉赫阿拉吉，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：丹麦,DK