用于从微藻生物质提取可溶性蛋白的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于从小球藻属微藻生物质制备分离蛋白的方法，其特征在于它包括以下步骤：供给一种由发酵产生的微藻生物质，洗涤该生物质，以便消除可溶性间质化合物并且浓缩该生物质，在卧式球磨机类型系统中对经过洗涤并且浓缩的生物质进行机械研磨，以产生一种乳液，将由此产生的乳液变构，三相分离，以便从包含脂质和细胞碎片的部分中分离可溶性部分，回收由此产生的可溶性部分，以产生可溶性分离蛋白，然后将所述分离蛋白蒸发、巴氏灭菌并雾化。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于从微藻生物质提取可溶性蛋白的方法本专利技术涉及一种用于从微藻生物质提取可溶性蛋白的方法。本专利技术还涉及以此方式获得的微藻分离蛋白。
技术介绍
所属领域技术人员熟知，小球藻是一种潜在的食物来源，因为它们富含蛋白质和其他必需营养素。它们被描述为包含45％的蛋白质、20％的脂肪、20％的碳水化合物、5％的纤维素和10％的矿物质和维生素。鉴于其丰度和氨基酸谱，微藻蛋白因此被认为是大豆蛋白或豌豆蛋白的替代性食物来源。蛋白部分也可以被开发为化妆品行业、或甚至医药行业中的功能剂。然而，由于在所述部分中存在不希望的化合物(例如叶绿素)而导致包含它们的食物组合物的颜色、味道和结构方面发生不希望的变化，所以在微藻蛋白的食品应用方面的发展尚不显著。为了增加其在食品应用中的潜力，并且也为了增加其商业价值，必须在不影响它们的分子结构的前提下从微藻中提取这些蛋白。“软”提取技术将因此需要分离具有高溶解度和良好技术和功能特性的蛋白质，但是微藻细胞壁的刚性，尤其绿色微藻的刚性，根本上与这一点矛盾，这是因为它破坏了细胞内蛋白质的提取和完整性。因此，与其相反，常规地“硬”的物理或化学条件被用来破坏微藻细胞壁。因此，许多研究提出了通过有机溶剂型或高压匀浆类型进行提取的技术。然而，在这些技术选择中，蛋白质的变性未认为是麻烦的，这是因为大多数的这些方法开发，是出于分析的目的，或意在提供用于酶消化的底物，从而产生水解蛋白。然而，保存细胞组分完整性的有效崩解方法不仅应最大化产率，而且应最大化提取的产物的质量。换言之，用于优化崩解壁的方法必须例如避免：-目标产物的化学污染，-使用过高的破裂能；后者可能导致感兴趣的细胞内分子的不可逆变性或降解。此外，对于大规模生产而言，对于选择的方法，重要的是可转换值这一规模。最后，这一细胞崩解步骤的引入必须是容易的，并且必须对随后的方法/处理步骤不具有负面影响。所有这些限制影响崩解方法的效率并且由于同样原因影响其能量消耗。这就是为什么珠磨机技术是优选的，因为它被认为对于按其天然形式释放细胞内蛋白质是有效的。在珠磨机中，将细胞与小球形颗粒一起以悬浮液状态搅动。细胞的破碎是由珠间剪切力、碾磨以及与珠的碰撞引起的。例如，专利US5330913中给出了一种适合的珠磨机的描述。这些珠使细胞破裂以从中释放细胞内容物。然后以“水包油”乳液形式获得粒径小于起源细胞的悬浮液。通常雾化此乳液并且消除水，然而留下包含由细胞碎片、间质可溶性化合物和油组成的异质混合物的干燥粉末。在使用这些细胞崩解技术时难以解决的是单独地分离细胞内内容物(以便排除膜碎片、糖、纤维和脂肪)，并且尤其是保存蛋白负载的质量。在四爿藻属的微藻的情况下，安雅施文茨法伊尔(AnjaSchwenzfeier)等人(生物资源技术(BioresourceTechnology)，2011，102，9121-9127)提出了保证分离蛋白质的溶解度和氨基酸谱质量的方法，其中污染物(例如染色物质)被除去，该方法包括以下步骤：-用珠磨机进行细胞崩解，-将磨碎的微藻悬浮液离心，-上清液的透析，-穿过离子交换树脂，-洗脱物的透析，-脱色，然后-洗涤和再悬浮。然而，这种实验室方法(用于处理24g的生物质)不能放大到工业规模，其中而将珠磨机方法用于回收完整生物质。此外，该方法不适合在其生物质中包含并非不显著脂质含量的微藻(例如在原壳小球藻中，脂质含量大于15％)。的确，即使在细胞壁的这种“相对软的”破裂之后，磨碎的细胞材料呈相对稳定的络合物“水包油”乳液的形式。因此，而在此阶段通常通过溶剂或机械地提取细胞组分，但是这有损害于其完整性。现有技术提出了第一解决方案，并且此外由本申请人公司测试了该第一解决方案，该方案包括将机械研磨与蒸发偶联，以便尝试将该乳液去稳定化，然后包括通过离心分离脂肪部分。然而，该分离步骤(碱性乳油化)的差的质量使得这种相分离方法的效率非常低。即使在此阶段推荐添加乙醇(20％-30％/原始)改进了该乳液的去稳定化，然而它仅使能够实现50％的级别的脱脂，甚至在低产率的情况下。此外，当该脂质部分与蛋白/多糖基质结合时，该机械途径是特别难以实施或甚至不可能实施的。另一个解决方案提出使用中性溶剂。然而，它面临巨大的限制(质量、安全性、法规等)。专利技术主题其结果是，对于提取并稳定化感兴趣的微藻的细胞组分的技术(通过机械研磨释放所述细胞组分)存在未满足的需要。本申请人公司已经发现，这一需要可以通过如下方式满足：通过提出从现有技术中已知的那些方法的替代方法，通过将用于机械研磨微藻细胞的方法与用于使通过选自由碱处理和酶处理组成的组中的处理产生的脂质部分变构的步骤，随后是离心的步骤组合。然后通过微孔过滤将脱脂可溶性部分澄清，然后超滤，以获得该分离蛋白。因此，本专利技术涉及一种用于从小球藻属微藻生物质制备分离蛋白的方法，该方法包括以下步骤：-提供一种由发酵产生的微藻生物质，-洗涤该生物质，以便消除间质可溶性化合物，并且浓缩，-在卧式珠磨机类型系统中实施对经过洗涤并且浓缩的生物质的机械研磨，以获得一种乳液，-将以此方式获得的乳液变构，-三相分离，以便从包含脂质和细胞碎片的部分中分离可溶性部分，-尤其通过微孔过滤，回收以及任选的澄清以此方式获得的可溶性部分，以便从中除去残留不溶性物质，以便获得可溶性分离蛋白，-在具有小于5kDa，优选在1kDa和5kDa之间的截止阈值的膜上对澄清的可溶性部分进行任选的超滤，以便获得一种可溶性分离蛋白，-在pH7下进行任选的中和，-将所述分离蛋白蒸发、巴氏灭菌并雾化。微藻生物质的选择优选地，小球藻属微藻选自由普通小球藻、根腐小球藻和原壳小球藻组成的组，并且更具体地是原壳小球藻。在一个具体实施例中，该菌株为原壳小球藻(菌株UTEX250-美国得克萨斯大学奥斯汀分校藻类培养物保藏中心(TheCultureCollectionofAlgaeattheUniversityofTexasatAustin-USA))。在另一个具体实施例中，该菌株为耐热性小球藻(菌株UTEX1663-美国得克萨斯大学奥斯汀分校藻类培养物保藏中心(TheCultureCollectionofAlgaeattheUniversityofTexasatAustin-USA))。在异养条件下并且在不存在光的情况下进行培养通常导致产生具有按干细胞的重量计，45％至70％的蛋白含量(通过测量氮含量N×6.25进行评估)的小球藻生物质。如将在下文示例，分两个步骤进行这一培养：-在包含葡萄糖和酵母提取物的培养基中进行预培养，在28℃下，伴随搅动，持续72h，然后-自身在葡萄糖和酵母提取物中持续多于36h，在28℃下，伴随搅动并且在用氨水调节的pH6.5下，进行用于产生生物质的培养，这生成具有按干细胞的重量计，52％的级别的蛋白含量(用Nx6.25进行评估)的大约80g/l的生物质。然后通过固液分离，通过正面过滤或切向过滤、或通过另外为本领域普通技术人员已知的任一方式收集生物质。有利地，本申请人公司然后推荐洗涤并浓缩生物质，以便通过生物质的一系列的浓缩(通过离心)/稀释来消除间质可溶性化合物。在工业规模上，有利地选择通过分一个阶段或两个阶段的离心，来进行顺序稀释和离心。出于本专利技术的目的，术语“间质可溶性化合物”本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于从小球藻属微藻生物质制备分离蛋白的方法，其特征在于它包括以下步骤：‑提供一种由发酵产生的微藻生物质，‑洗涤该生物质，以便消除间质可溶性化合物并且浓缩，‑在卧式珠磨机类型系统中实施对经过洗涤并且浓缩的生物质的机械研磨，以获得一种乳液，‑将以此方式获得的乳液变构，‑三相分离，以便从包含脂质和细胞碎片的部分中分离可溶性部分，‑回收以此方式获得的可溶性部分，以获得可溶性分离蛋白，然后‑将所述分离蛋白蒸发、巴氏灭菌并雾化。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.07.18 FR 14569461.一种用于从小球藻属微藻生物质制备分离蛋白的方法，其特征在于它包括以下步骤：-提供一种由发酵产生的微藻生物质，-洗涤该生物质，以便消除间质可溶性化合物并且浓缩，-在卧式珠磨机类型系统中实施对经过洗涤并且浓缩的生物质的机械研磨，以获得一种乳液，-将以此方式获得的乳液变构，-三相分离，以便从包含脂质和细胞碎片的部分中分离可溶性部分，-回收以此方式获得的可溶性部分，以获得可溶性分离蛋白，然后-将所述分离蛋白蒸发、巴氏灭菌并雾化。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于这些小球藻属微藻选自由普通小球藻、根腐小球藻和原壳小球藻组成的组，并且更具体地是原壳小球藻。3.如权利要求1和2中任一项所述的方法，其特征在于通过酶预消化、通过用极性溶剂进行处理和/或通过靶向该乳液的蛋白部分的受控碱处理，来使该乳液...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·帕蒂尼尔，
申请(专利权)人：罗盖特公司，
类型：发明
国别省市：法国,FR