双特异性四价抗体及其制造和使用方法技术

一种双特异性四价抗体，其包含具有一对重链和一对轻链的IgG，和连接到重链或轻链的C或N端的两个scFv组分。所述双特异性四价抗体可具有对EGFR家族中两个不同成员的结合特异性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】双特异性四价抗体及其制造和使用方法相关专利申请的交叉参考本申请要求2014年12月22号提交的美国临时申请第62095348号，名称为“双特异性抗体”的优先权，该文件全部内容在此引入作为参考。序列表与本申请相关联的序列表是以文本格式代替纸件副本的形式来提供，并且以引用方式并入本说明书中。包含所述序列表的文本文件名是序列表_ST25_0003PCT2.txt。所述文本文件大约227KB，在2015年12月18号创建，并经由EFS-Web进行电子提交。
本公开总体涉及抗体治疗试剂
，尤其涉及针对EGFR家族两个不同成员的双特异性四价抗体。
技术介绍
ErbB/HER受体家族成员例如EGFR、HER2、HER3、HER4的过量表达和/或失调，已经表明在癌症的肿瘤发生中起重要作用。EGFR或者HER2的突变和扩增产生异常生长信号，其激活促成肿瘤发生的下游信号途径。针对EGFR和HER2的治疗性抗体和小分子抑制剂已被批准用于癌症的治疗(Arteaga等人,NatureReviewsClinicalOncology916-32,January2012)。针对EGFR家族成员，如EGFR和HER2的单克隆抗体已经在结肠癌(Price等人.,TheLancetOncology15(6),Pages569-579,May2014)、头颈部鳞状细胞瘤(Cohen,CancerTreatmentReviews40(2014)567-577)、乳癌和胃癌(Arteaga等人,NatureReviewsClinicalOncology916-32,January2012)中表现出良好的临床反应。几种治疗性抗EGFR抗体，包括西妥昔单抗、帕尼单抗和尼妥珠单抗是已获准用于几种癌症包括转移性结肠直肠癌、头颈部鳞状细胞癌和神经胶质瘤的疗法(Price和Cohen,CurrTreatOptionsOncol.2012Mar；13(l)：35-46；Bode等人,ExpertOpinBiolTher.2012Dec；12(12):1649-59)。令人遗憾的是最初对这些治疗剂反应的许多肿瘤由于对药剂的获得性抗性而最终发生进展(Jackman等人.JClinOncol2010；8:357-60)。因此仍然存在着对更好的癌症治疗方法需求。
技术实现思路
本公开提供了双特异性四价抗体。双特异性四价抗体可以包括具有两条重链和两条轻链的免疫球蛋白G(IgG)部分，以及与重链或轻链的C或N末端共价连接的两个scFv部分。IgG部分可具有与EGFR家族第一成员结合的特异性。scFv部分可具有与EGFR家族第二成员结合的特异性。IgG部分和两个scFv部分共价连接以作为双特异性四价抗体起作用。为使本公开的目的和有益效果更加清楚，下面将结合相应的附图详细阐述优选实施例。附图说明现在参考附图详细描述本公开的优选实施例，其中类似的参考标号表示类似的元件。图1是示出了实例二价单特异性免疫球蛋白G(IgG)抗体的结构域结构的图。图2是示出了根据本专利技术的一个实施例，包含IgG部分和2个scFv部分的实例四价双特异性抗体的结构域的图。图3示出了实例四价双特异性抗体1X1、1X2、1X3、1X4、1X4.2、1X5和1X6的结构域结构图。图4示出了SI-1X4和SI-1X4.2之间的VH结构域序列比较，示出了5个氨基酸差异。图5和6是示出了利用BLI的单体EGFR结合的图。图7、8和9是示出了双特异性ELI结合的图。图10是示出了二聚EGFRELISA的图。图11示出了SI-1C5.2和SI-1X4.2与单体EGFR通过Octet分析的结合动力学。图12示出了SI-1X抗体与A431细胞结合的流式细胞仪分析。图13示出了SI-1X抗体与BxPC3细胞结合的流式细胞仪分析。图14示出了SI-1X4.2抗体与Fadu细胞结合的流式细胞仪分析。图15示出了SI-1X4.2抗体与A431细胞结合的流式细胞仪分析。图16示出了SI-1X抗体对A431细胞增殖的作用。图17示出了SI-1X抗体对A431细胞增殖的作用。图18示出了SI-1X抗体对BxPC3细胞增殖的作用。图19示出了SI-1X抗体对BxPC3细胞增殖的作用。图20示出了SI-1X4.2抗体对Fadu细胞增殖的作用。图21示出了SI-1X4.2抗体对A431细胞增殖的作用。图22示出了SI-1X抗体对Fadu细胞的ADCC活性。图23示出了SI-1X抗体对NCI-H1975细胞的ADCC活性。图24示出了SI-1X抗体的热熔性以展示其热稳定性。图25示出SI-1X抗体在七天时间内的血浆稳定性。图26是示出经EGFR包被的ELISA用于大鼠PK研究的结果图。图27是示出经HER3包被的ELISA用于大鼠PK研究的结果图。图28是示出夹心ELISA用于大鼠PK研究的结果图。图29是示出小鼠异种移植研究中平均肿瘤体积对天数的曲线图图30是示出小鼠异种移植研究中相对体重对周数的曲线图。具体实施方式本公开提供了较目前已知的抗EGFR抗体，具有更优异治疗特性或者疗效的双特异性四价抗体。在一个实施例中，抗体靶向EGFR家族的两个成员，包括但不限于EGFR和HER3。双特异性四价抗体可同时抑制EGFR和HER3介导的信号传导，因而克服EGFR抑制剂或单克隆抗体治疗中的耐药性。必须注意，如本文和所附权利要求书中所用，贯穿本说明书和权利要求书的单数形式“一(a)”、“一个(an)”以及“所述(the)”、单词“包含(comprise)”或变形例如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”应理解为意味着包括所叙述的整体或者整体的组合，但是并不排除任何其他的整体或者整体的组合，包括复数对象，除非上下文另外清楚地说明。“抗体片段”包含完整抗体的部分,优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fv、Fab、Fab'、F(ab')2、Fab'-SH；diabodies；线性抗体(参考美国专利第5641870号实例2；Zapata等，ProteinEng.8(10):1057-1062(1995))；单链抗体分子(例如scFv)尽管在本描述中，并且在整个说明书中，提到了抗体和抗体的各种性质，但是相同的公开内容也适用于功能性抗体片段，例如，双效Fab片段。在一方面，双特异性四价抗体可以包括具有两条重链和两条轻链的免疫球蛋白G(IgG)部分，以及与重链或轻链的C或N末端共价连接的两个scFv部分。IgG部分可具有与EGFR家族第一成员结合的特异性。scFv部分可具有与EGFR家族第二成员结合的特异性。IgG部分可以为scFv部分提供稳定性。双特异性四价抗体可阻断AKT和MAPK/ERK途径的信号传导，并且可以介导针对表达一种或两种抗原的细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一个实施例中，双特异性四价抗体能够同时结合两种抗原。在一些实施例中，与单特异性抗体亲本对照或单特异性抗体亲本对照的组合相比，双特异性四价抗体在体外和体内增殖试验中提供更强的肿瘤抑制。在一个实施例中，本公开提供具有两条IgGl重链、两条κ轻链和两条单链Fv(scFv)结构域的双特异性四价抗体。两条IgG1重链和κ轻链形成对EG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双特异性四价抗体，所述双特异性四价抗体包含：两条IgGl重链；两条κ轻链；以及两个单链Fv(scFv)结构域；其中所述两条IgGl重链和κ轻链形成对EGFR家族的第一成员具有结合特异性的IgG部分；其中所述两个scFv结构域对EGFR家族的第二成员具有结合特异性，且每个scFv结构域通过具有(gly‑gly‑gly‑gly‑ser)

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.22 US 62/095,3481.一种双特异性四价抗体，所述双特异性四价抗体包含：两条IgGl重链；两条κ轻链；以及两个单链Fv(scFv)结构域；其中所述两条IgGl重链和κ轻链形成对EGFR家族的第一成员具有结合特异性的IgG部分；其中所述两个scFv结构域对EGFR家族的第二成员具有结合特异性，且每个scFv结构域通过具有(gly-gly-gly-gly-ser)n的氨基酸序列的连接体连接到所述IgGl重链中任一个的C-端，以提供IgGl-连接体连接，其中n是至少1的整数；以及其中每个单链Fv结构域具有N端-重链可变区-接头-轻链可变区-C端或N-端-轻链可变区-接头-重链可变区-C-端的结构顺序，其中所述接头由(gly-gly-gly-gly-ser)m的氨基酸序列组成，其中m是至少3的整数。2.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中n是1至10的整数。3.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中m是3、4、5、或6。4.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中所述IgGl重链中至少一个是人源化或人IgGl重链。5.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中所述两个IgGl重链是人源化或人IgGl重链。6.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中所述κ轻链中至少一个是人源化或人κ轻链。7.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中两条κ轻链均是人源化或人κ轻链。8.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中所述EGFR家族的所述第一或所述第二成员包含HER3、EGFR、其片段或衍生物。9.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中所述EGFR家族的所述第一或所述第二成员独立地选自由HER3、EGFR、其片段或衍生物组成的组。10.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中所述IgG部分具有对HER3的结合特异性。11.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中所述单链Fv结构域具有对EGFR的结合特异性。12.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中所述IgG部分具有对HER3的结合特异性并且所述单链Fv结构域同时具有对EGFR的结合特异性。13.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中所述IgG部分具有对EGFR的结合特异性。14.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中所述单链结构域具有对HER3的结合特异性。15.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中所述IgG部分具有对EGFR的结合特异性并且所述单链Fv结构域同时具有对HER3的结合特异性。16.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中所述IgGl重链中至少一个的所述C端缺失一个氨基酸残基。17.根据权利要求16所述的双特异性四价抗体，其中所述氨基酸残基是赖氨酸。18.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中所述IgGl-连接体连接能抵抗蛋白酶活性。19.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中所述IgGl重链中至少一个包含在CH3结构域中的两个突变，其中所述两个突变回复成人CH3结构域中的通用残基。20.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中所述IgGl重链中至少一个包含含有SEQIDNO7、15、23、31、39、47和127的氨基酸序列。21.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中所述IgGl重链、连接体和单链Fv结构域具有包含SEQIDNO56、66、76、86、98、108、118和136的氨基酸序列。22.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中所述κ轻链中至少一个包含含有SEQIDNO3、11、19、27、35、43、51、61、71、81、92、103、113、123和131的氨基酸序列。23.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中轻链可变区中至少一个包含含有SEQIDNO4、12、20、28、36、44、52、62、72、82、93、104、114、124和132的氨基酸序列。24.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中重链可变区中至少一个包含含有SEQIDNO8、16、24、32、40、48、57、67、77、87、99、109、119、128和137的氨基酸序列。25.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中所述IgG部分具有对HER3的结合特异性，并且所述单链Fv结构域具有对EGFR的结合特异性；其中所述IgGl重链、连接体和单链Fv结构域具有SEQIDNO56的氨基酸序列，并且所述κ轻链具有SEQIDNO51的氨基酸序列。26.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中所述IgG部分具有对HER3的结合特异性，并且所述单链Fv结构域具有对EGFR的结合特异性；其中所述IgGl重链、连接体和单链Fv结构域具有SEQIDNO76的氨基酸序列，并且所述κ轻链具有SEQIDNO71的氨基酸序列。27.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中所述IgG部分具有对HER3的结合特异性，并且所述单链Fv结构域具有对EGFR的结合特异性；其中所述IgGl重链、连接体和单链Fv结构域具有SEQIDNO108的氨基酸序列，并且所述κ轻链具有SEQIDNO103的氨基酸序列。28.根据权利要求1所述的双特异性四价抗体，其中所述IgG部分具有对EGFR的结合特异性，并且所述单链Fv结构域具有对HER3的结合特异性；其中所述IgGl重链、连接体和单链Fv结构域具有SEQIDNO66的氨基酸序列，并且所述κ轻链具有SEQIDNO61的氨基酸序列。...

【专利技术属性】
技术研发人员：高泽人，菲尔·谭，布莱恩·科瓦切维奇，布莱尔·伦肖，杰弗里·阿达莫，麦雅丝，卓识，陈澜，
申请(专利权)人：西雅图免疫公司，
类型：发明
国别省市：美国,US