连接蛋白半通道的特异性调节剂制造技术

本发明专利技术提供了由连接蛋白形成的半通道的特异性调节剂的鉴定方法，所述鉴定方法采用了结构生物信息学方法来计算能选择性调节由连接蛋白形成的半通道的配体和组合物的相互作用能量。在其它方面中，本发明专利技术描述了一种计算机辅助方法，其中评估来自化学化合物的数据库的配体之间的相互作用能量成为可能，具有区域限定的结合口袋，所述区域包括连接蛋白26中原体的残基3‑10(NTH)、29‑40(TM1)、74‑93(TM2)和邻近原体的残基29‑40(TM1)或者其它连接蛋白中的等价残基。特别地，本发明专利技术提供了通过以上所述方法所鉴定特异性抑制连接蛋白半通道的激活/开启的化合物，所述化合物可以用于治疗炎性疾病、血管紊乱、心律失常、慢性损伤、视网膜神经保护，疼痛治疗，骨骼肌去神经支配，肌营养不良，脊髓损伤和以由连接蛋白形成的半通道的活性增加为特征的遗传疾病。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】连接蛋白半通道的特异性调节剂
本专利技术涉及鉴定由连接蛋白形成的半通道的特异性调节化合物(阻断剂)的方法、在此方法学下所鉴定的化合物的新用途和包括这些化合物以用于治疗与由连接蛋白形成的半通道的活性增加相关的疾病的药物组合物，所述疾病诸如炎性疾病、血管紊乱、心律失常、慢性损伤、视网膜神经保护，疼痛治疗，骨骼肌去神经支配，肌营养不良，缺血后再灌注(例如：心脏或脑梗塞)，脊髓损伤和以由连接蛋白形成的半通道的活性增加为特征的遗传疾病。
技术介绍
连接蛋白(connexin)为内在膜蛋白，其在原生质膜中呈六边形布置，即称之为连接子或半通道。两个半通道可通过它们的胞外片段结合在一起以便形成通道间隙连接或者间隙连接，这允许许多物质在细胞间直接转移(Sáez,Merthoudetal.2003)。在过去的十年里，已经显示出在生理条件下，半通道在代谢产物和营养物的转移中发挥了重要作用(ChandrasekharandBera2012)，而且其在细胞间信号分子(诸如ATP、谷氨酸、前列腺素E2和NAD+)的释放中也发挥了重要作用，提供了用于自分泌和旁分泌信号在膜中的路径(Wang,DeBocketal.2012)。但是，在不同的病理条件下，由连接蛋白形成的半通道的活性被上调，且显著促进细胞变性的结果(Sáez,Schalperetal.2010)。最近通过X射线晶体学的至分辨率的连接蛋白的晶体结构测定(Maedaetal.2009)显示半通道是间隙连接的保守动机，且它们可被看作结构单元模块(Yeager,2009)。由连接蛋白26形成的半通道结构显示每个单体由4个跨膜α螺旋(TM1-TM4)、2个胞外环(E1、E2)、1个胞内环以及一个N-端螺旋结构域(NTH)和C-端结构域组成。每个连接包含6个原体的布置且连接蛋白26的每个单体包含典型的四螺旋束，其中任何相邻的螺旋对是反平行的(MaedaandTsukihara,2011)。连接蛋白26的第二种结构的布置如下：各自地，TM1、TM2和E1面向孔；TM3、TM4和E2分别位于半通道的周边中，所述半通道在膜脂或胞外环境之前；TM2和TM1位于细胞质中的一半被NTH覆盖，且它们没有被暴露(图1)。数条研究表明由连接蛋白形成的通道的特异性抑制剂的应用能够在癫痫，心律失常，癌症，中风或其它状况中具有治疗作用(Spray,Rozentaletal.2002)。虽然通过电生理技术和采用重组蛋白的体外实验已经可以鉴别据说能直接作用在半通道或者通道以调节它们的功能的药物，但是对于大部分(若非全部)到目前为止所报道的由连接蛋白形成的半通道抑制剂，它们的活性通过何种精确机制来调节以及转运的特性仍旧未知(JuszczakandSwiergiel2009)。此外，到目前为止所描述的所有化合物在微摩尔浓度都是有效的，这显示它们几乎不具有选择性且它们中的许多还阻断了由panexin形成的半通道(VarselisandSrinivas2013)。因此，迫切地需要药理学工具以进一步明确它们的功能并验证它们作为药理学靶标，用于发展针对基于连接蛋白功能紊乱的疾病的新的治疗方法(BodendiekandRaman2010)。目前存在数种连接蛋白调节剂，但是它们中的大多数同时影响由连接蛋白形成的半通道和通道的活性。此外，抑制连接蛋白表达的反义RNA或者吗啉代的使用消除了半通道和间隙连接两者的表达。因此，现有技术中所描述的化合物显示出几乎没有功效和非特异性的作用机制或非特异性继发于其它修饰连接蛋白活性的治疗靶标(例如激酶)的药理学作用。在现有阶段中存在描述了调节由连接蛋白形成的半通道的活性的组合物和方法的例如EP1469875,US7153822,WO2003063891,US20040092429,US20070042964yWO2006134494专利或专利申请。在这样的文献所提出的机制中，存在连接蛋白43的C-端片段中的酪氨酸残基的磷酸化，通过采用肽模拟物阻断了2个半通道的结合，所述肽模拟物与半通道或者其跨膜区之间的结合区域类似，所述跨膜区修饰半通道的形成。但是，这些化合物对通过半通道的转运没有选择性，而且它们还非特异性地影响间隙连接通道，。此外，专利申请WO2007002139要求保护一种在视网膜细胞中通过降低响应于本地高血压的连接蛋白介导的ATP释放的神经保护方法。在此申请中，指定半通道阻断剂可以为甲氟喹，甲氯灭酸，视黄酸，18-α-巨青霉烯酸(18-alpha-gliciretinicacid)，氟灭酸，尼氟酸(riflumicacid)，生胃酮，肽模拟物或其组合。但是，这些化合物对由连接蛋白形成的半通道没有选择性，因为它们还阻断了间隙连接通道，药理学作用依赖于ATP的转运，所述ATP能够通过另外的方式转运到半通道。在其它实例中，诸如申请WO2009148613，引入反义寡核苷酸、干扰RNA或者siRNA的应用以抑制位于两细胞之间的细胞间通道的表达，所述细胞间通道作为细胞表面的半通道。但是，这些寡核苷酸特异性调节连接蛋白43同工型(在人类中存在20种额外的连接蛋白)，且它们仅允许用于经皮给药、静脉注射或者沉积给药(depositadministration)形式的制剂。在申请JP2011506446中，描述了抗体或者结合抗原的片段的应用，其在慢性炎性疾病中并没有效，因为会产生强烈的排斥反应或过敏反应。鉴于此，对于具有调节由连接蛋白形成的半通道的形成、打开或者活性功能的药物的极大兴趣是显而易见的。在申请US20110223204中，调节试剂的采用被要求保护，所述调节试剂为反义寡核苷酸、核酶、RNAi或者具有长度在15-35个核苷酸之间并具有与连接蛋白43的mRNA反义序列至少70％同源性的siRNA。这些生物学衍生物可仅通过同工型连接蛋白43选择，且其具有阻止由连接蛋白43形成的半通道和间隙连接的形成的效果。间隙连接的形成的阻断对器官表达连接蛋白43的正常活动是有害的副作用。此外，所述的化合物显示了对寡核苷酸的普遍限制作用，例如它们不能口服给药，而且它们应当以另一种静脉注射的药物形式类型进行制剂。文献US20090143425描述了衍生自喹啉类影响间隙连接的化合物。但是，这些化合物并不是由连接蛋白形成的半通道的选择性抑制剂。申请US20090163440描述了离子通道的调节，特别是由连接蛋白43组成的通道的调节，其中所采用的用于调节它们的药物选自已知的不同的离子通道调节剂：氨氯地平，苄普地尔，地尔硫卓，达舒平，恩卡尼，非洛地平，加洛帕米，伊拉地平，脉律定，尼卡地平，硝苯地平，尼莫地平，尼群地平，普鲁卡因胺，奎尼丁，河豚毒素，戊脉安。在所述文献中的以上描述的所有选择中，仅有奎尼丁显示出针对连接蛋白通道的非特异性和低效价的活活性。在专利申请US20120135960和US20110172188中，描述了甲氟喹在众多之中被描述为连接蛋白阻断试剂。但是，甲氟喹是对由连接蛋白Cx26、Cx32、Cx36、Cx43和Cx50形成的间隙连接通道的非选择性阻断剂。此化合物没有选择性抑制由所述连接蛋白形成的半通道。文献US20080131528、US20060228433和US20080096854描述了本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定连接蛋白半通道的特异性抑制化合物的方法，其中，所述方法包括：a)分析所述连接蛋白的结构作为参考；b)生成连接蛋白的对比模型；c)进行模拟筛选以便鉴定由连接蛋白形成的半通道的调节剂；d)评估所述化合物调节通过细胞的细胞膜运输的能力，作为抑制化合物的参考，所述的细胞的半通道表达缺陷并用不同连接蛋白转染；e)根据它们对所述半通道的作用，对抑制由连接蛋白形成的所述半通道的所述分子进行分类。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.06.12 CL 1556-20141.一种鉴定连接蛋白半通道的特异性抑制化合物的方法，其中，所述方法包括：a)分析所述连接蛋白的结构作为参考；b)生成连接蛋白的对比模型；c)进行模拟筛选以便鉴定由连接蛋白形成的半通道的调节剂；d)评估所述化合物调节通过细胞的细胞膜运输的能力，作为抑制化合物的参考，所述的细胞的半通道表达缺陷并用不同连接蛋白转染；e)根据它们对所述半通道的作用，对抑制由连接蛋白形成的所述半通道的所述分子进行分类。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述参考的连接蛋白对应于连接蛋白26和/或43。3.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(a)中所述参考的连接蛋白为人类连接蛋白26。4.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(b)中所述对比模型基于结构域中的相互作用能量的评估，所述结构域阻止构像改变以便产生所述由连接蛋白形成的半通道的开启/激活。5.根据权利要求4所述的方法，其中，在被半通道中的N-端螺旋(NTH)和连接蛋白原体的α-螺旋1和2的跨膜片段以及另一个原体的α-螺旋1的跨膜片段所限定的结构域中，评估相互作用能量。6.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(c)中，采用所述参考的连接蛋白组成的半通道的结构和半通道模型进行模拟筛选，所述半通道模型是采用参考连接蛋白结构作为样式比较建模，由比较连接蛋白形成的。7.根据权利要求6所述的方法，其中，在步骤(c)中所述比较连接蛋白为连接蛋白43。8.根据权利要求6所述的方法，其中，在步骤(c)中，所述模拟筛选采用的配体是针对对应于连接蛋白26、43或其它连接蛋白的半通道的蛋白的晶体结构或对比模型。9.根据权利要求8所述的方法，在受残基限制的结合位点评估化合物的相互作用能量，所述残基对应于连接蛋白26中原体的残基3-10(NTH)、29-40(TM1)、74-93(TM2)的片段和邻近原体的残基29-40(TM1)或者其它连接蛋白中的等同残基。10.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(d)中所述参考抑制剂为β甘草次酸(BGA)、生...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·C·赛斯，C·拉各斯，
申请(专利权)人：智利天主教大学，
类型：发明
国别省市：智利,CL