钩吻素子的肝微粒体代谢分析及相关动物的毒代动力学制造技术

本发明专利技术公开一种钩吻素子的肝微粒体代谢分析及相关动物的毒代动力学。本发明专利技术方法主要包括以下步骤：1.KM肝微粒体代谢分析，包括以下步骤：（1）肝微粒体孵育体系建立；（2）样本处理；（3）样本分析，通过比较KM在各种实验动物肝微粒体的代谢产物分布特点及各种属肝微粒体对KM代谢的动力学特征，进行KM人类相关动物的选择。2. KM恒河猴急性毒性伴随毒代动力学，包括以下步骤：（1）染毒实验动物的血液样本采集及血浆样本处理；（2）定量检测；（3）血药浓度数据分析。本发明专利技术优点在于通过KM在各种实验动物体外肝微粒体代谢分析，选择人类相关动物进行相伴毒代动力学研究，以提高实验动物毒性评价对临床的可预测性。

Analysis of liver microsomal metabolism and related animal Koumine toxicokinetics

Analysis of liver microsomal metabolism and related animal disclosed the toxicokinetics of koumine. The method of the invention comprises the following steps: 1.KM analysis of liver microsomal metabolism, which comprises the following steps: (1) the establishment of liver microsomes; (2) sample processing; (3) the sample analysis, through the comparison of the KM in various experimental animal liver microsomal metabolite distribution characteristics and kinetic characteristics of KM belongs to liver microsomal metabolism the KM of human animal selection. 2 KM Ganges RIver monkey acute toxicity of concomitant toxicokinetics, which comprises the following steps: (1) in experimental animal blood samples and samples of plasma processing; (2) quantitative detection; (3) analysis of blood concentration data. The invention has the advantages of using KM in various experimental animal liver microsomes in vitro analysis, selection of human animal concomitant toxicokinetic studies, in order to improve the experimental animal toxicity evaluation of clinical predictability.

【技术实现步骤摘要】
钩吻素子的肝微粒体代谢分析及相关动物的毒代动力学
本专利技术是涉及生物化学分析及生物代谢领域，具体涉及KM的肝微粒体代谢分析及相关动物急性毒性伴随毒代动力学，为后期临床研究提供科学依据。
技术介绍
钩吻素子（koumine，KM）是马钱科植物胡蔓藤钩吻的主要活性生物碱中含量最高的成分，研究提示其具有高效低毒的作用，具有抗肿瘤、镇痛镇静、抗焦虑、治疗类风湿关节炎等多种药理作用，并获得了KM治疗慢性疼痛及类风湿性关节炎的国家专利，因此就目前已开展的研究显示了KM具有巨大的药效学应用前景。前期本课题组专利技术的“高速逆流色谱法从钩吻中分离制备钩吻生物碱单体的方法”（已授权，授权公告号:CN101323618B），该专利技术提供了高效、速效获得钩吻素子的途径，为钩吻素子的产业化应用奠定基础。非临床药代动力学研究在新药研究开发的评价过程中起着重要作用，通过阐明药代动力学特征，为药物制剂学研究和评价提供重要依据，在药效学和毒理学评价中有助于深入阐明药物作用机制以及为实验方案设计提供参考依据，尚能为设计和优化临床试验方案提供有关参考信息。新药研究开发是一个包括动物和人体安全性评价的逐步推进的过程，非临床安全性评价可以确定潜在的毒性靶器官和毒性反应出现的时间、性质、程度、及其可逆性；确定临床监测的安全性参数；推算人体使用等的安全起始剂量以及随后的剂量递增方案等。而毒代动力学研究是药物非临床安全性评价的重要内容，可解释药物毒性试验结果,发现毒性的剂量水平和时程的关系,提高毒性研究资料的价值。但钩吻生物碱的毒效作用存在明显的种属差异，如，钩吻对人有剧毒，而对猪和羊等动物却有益。有研究认为：导致这种差异是猪羊等动物对钩吻有良好的耐受性，含有对抗、抑制、转化或者降解这种毒素的酶，即可能与存在生物代谢方面的差异有关。因此，仅以常规动物进行药物的代谢研究不能最真实的反映药物的代谢情况，即无法为临床研究提供可靠的参考依据。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的提供一种钩吻素子的肝微粒体代谢分析及相关动物的毒代动力学测试方法，是通过体外代谢研究判断和选择KM人类相关动物，再以相关动物为实验动物进行伴随毒代动力学研究，以提高实验动物毒性评价对临床的可预测性，为临床研究提供更为可靠的参考依据。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：KM的肝微粒体代谢分析，包括以下步骤：（1）肝微粒体孵育体系建立在EP管中依次加入相应种属的肝微粒体及所需浓度的KM、PBS，置37℃恒温振荡箱中预孵育5min，再加入预孵育的NADPH溶液20μL启动反应，置37℃恒温振荡箱中孵育一定时间后立即加入800μL的纯冰乙腈终止反应并沉淀蛋白；通过对孵育时间、肝微粒体蛋白含量和KM浓度等条件的考察优化KM与肝微粒体的反应体系，在反应体系的优化反应条件下，测定不同浓度KM在各种属肝微粒体反应体系中随孵育时间的浓度变化；所用KM浓度范围为0.05~1.25g·L-1，孵育时间范围为0.25~4h；（2）样本处理将上述步骤（1）的孵育体系涡旋3min混匀，15000r·min-1，4℃下离心15min后取上清液700μL；离心获得的沉淀再加700μL冰乙腈进行同法萃取，合并萃取液，氮气浓缩仪中挥干后，用100μL25%乙腈复溶，涡旋3min后15000r·min-1，4℃下离心15min，过滤，取上清液进样；（3）样本分析采用UPLC进行待测样品测定，通过比较KM在各种属肝微粒体的代谢产物分布特点以及根据随行标准曲线计算各时间点KM的浓度，按照底物消除法计算米氏常数Km、最大反应速率Vmax和半衰期T1/2，具体条件如下：色谱条件：安捷伦PoroshellHPH-C18液相色谱柱；柱温：30℃；流动相：乙腈-0.1%正丁胺水溶液，乙腈、0.1%正丁胺水溶液体积比为25∶75；检测器：DAD检测器；进样量：1μL；流速：0.3mL·min-1；检测波长：256nm。所述的优化反应条件为各种属肝微粒体反应体系的最佳孵育时间分别为人和小型猪4h，SD大鼠和比格犬3h，恒河猴2h；肝微粒体最佳浓度均为0.5g·L-1；KM反应浓度为0.25g·L-1。所述色谱柱型号为安捷伦PoroshellHPH-C18的2.1mm×100mm，2.7μm的液相色谱柱。所述肝微粒体为人、小型猪、SD大鼠、恒河猴和比格犬的肝微粒体。KM的相关动物伴随毒代动力学研究，包括以下步骤：（1）染毒实验动物的血液样本采集及血浆样本处理染毒实验动物采血后的血浆样本解冻后，取血浆100µL，置于2mL离心管中，加入75ng·mL-1的钩吻素甲内标10µL，涡旋混合，加入萃取剂乙酸乙酯400µL，涡旋混合3min后12000r·min-1，4℃下离心5min，取上清有机相于另一离心管，于60℃下氮吹仪挥干，残留物于100µL流动相复溶，涡旋混合3min后12000r·min-1，4℃下离心10min，取上清液经0.22µm过滤，吸取5µL待测样品进行LC-MS/MS分析；（2）定量检测采用HPLC-MS/MS对步骤（1）的待测样品进行定量测定，具体条件如下：色谱条件：仪器：Agilent1200型HPLC；色谱柱：GeminiC18液相色谱柱；流动相：甲醇-水-氨水，甲醇、水、氨水体积比为49:51:0.00625；流速：0.2mL·min-1；柱温：30℃；进样量：5μL；质谱条件：仪器：Agilent6410BLC/MS三重串联四极杆；离子源：正离子模式ESI；干燥气流速：10L/min；干燥气温度：350℃；喷雾气：25psi；Vcap：3500V；KM：碰撞诱导解离电压140V、碰撞能量56V、MRM离子307.2→180.2、驻留时间200ms；GM：碰撞诱导解离电压135V、碰撞能量25V、MRM离子323.2→236.1、驻留时间200ms；（3）血药浓度数据分析测定KM血药浓度，用DAS3.0软件计算染毒实验动物的毒代动力学参数。所述KM人类相关动物为恒河猴。所述色谱柱型号为Gemini5μC18的110A，50×2.0mm的液相色谱柱。所述染毒实验动物的血液样本采集步骤为：取3~4岁恒河猴8只，分为阴性对照组和给药组，每组动物4只，雌雄各半，采用累积剂量法进行急性毒性试验，每天鼻饲给予一个剂量，给药顺序按5、10、20、40、80mg·kg−1由低剂量往高剂量连续5天逐天给药，给药容量为5mL·kg−1，于给药第一天及第四天给药前及给药后5、20、60、120、240、480、1440min采血进行伴随毒代动力学研究。本专利技术的有益效果是：通过前期体外肝微粒体温孵试验，比较了KM的肝微粒体酶代谢过程在人与实验动物之间的相似性和差异性，可以判断何种动物为人类相关动物，在伴随毒代动力学研究中选择相关动物作为实验动物进行测试，以提高实验动物毒性评价对临床的可预测性。附图说明图1为反应条件优化：KM代谢曲线（A、B上半部分）和主要代谢产物生成曲线（C及A、B下半部分）。图2为KM在各种属肝微粒体代谢的UPLC图谱（λ=256nm），图中：肝微粒体浓度：0.5g·L-1；KM浓度：0.25g·L-1；孵育时间：人和猪4h、大鼠和犬3h、猴2h；Ⅰ~Ⅸ：代谢物按保留时间先后顺序编号。图3为KM在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种KM的肝微粒体代谢分析，其特征在于：包括以下步骤：（1）肝微粒体孵育体系建立在EP管中依次加入相应种属的肝微粒体及所需浓度的KM、PBS，置37 ℃恒温振荡箱中预孵育5 min，再加入预孵育的NADPH溶液20 μL启动反应，置37 ℃恒温振荡箱中孵育一定时间后立即加入800μL的纯冰乙腈终止反应并沉淀蛋白；通过对孵育时间、肝微粒体蛋白含量和KM浓度等条件的考察优化KM与肝微粒体的反应体系，在反应体系的优化反应条件下，测定不同浓度KM在各种属肝微粒体反应体系中随孵育时间的浓度变化；所用KM浓度范围为0.05~1.25 g·L

【技术特征摘要】
1.一种KM的肝微粒体代谢分析，其特征在于：包括以下步骤：（1）肝微粒体孵育体系建立在EP管中依次加入相应种属的肝微粒体及所需浓度的KM、PBS，置37℃恒温振荡箱中预孵育5min，再加入预孵育的NADPH溶液20μL启动反应，置37℃恒温振荡箱中孵育一定时间后立即加入800μL的纯冰乙腈终止反应并沉淀蛋白；通过对孵育时间、肝微粒体蛋白含量和KM浓度等条件的考察优化KM与肝微粒体的反应体系，在反应体系的优化反应条件下，测定不同浓度KM在各种属肝微粒体反应体系中随孵育时间的浓度变化；所用KM浓度范围为0.05~1.25g·L-1，孵育时间范围为0.25~4h；（2）样本处理将上述步骤（1）的孵育体系涡旋3min混匀，15000r·min-1，4℃下离心15min后取上清液700μL；离心获得的沉淀再加700μL冰乙腈进行同法萃取，合并萃取液，氮气浓缩仪中挥干后，用100μL25%乙腈复溶，涡旋3min后15000r·min-1，4℃下离心15min，过滤，取上清液进样；（3）样本分析采用UPLC进行待测样品测定，通过比较KM在各种属肝微粒体的代谢产物分布特点以及根据随行标准曲线计算各时间点KM的浓度，按照底物消除法计算米氏常数Km、最大反应速率Vmax和半衰期T1/2，具体条件如下：色谱条件：安捷伦PoroshellHPH-C18液相色谱柱；柱温：30℃；流动相：乙腈-0.1%正丁胺水溶液，乙腈、0.1%正丁胺水溶液体积比为25∶75；检测器：DAD检测器；进样量：1μL；流速：0.3mL·min-1；检测波长：256nm。2.根据权利要求1所述的KM的肝微粒体代谢分析,其特征在于：步骤（1）所述的优化反应条件为各种属肝微粒体反应体系的最佳孵育时间分别为人和小型猪4h，SD大鼠和比格犬3h，恒河猴2h；肝微粒体最佳浓度均为0.5g·L-1；KM反应浓度为0.25g·L-1。3.根据权利要求1所述的KM的肝微粒体代谢分析,其特征在于：步骤（3）色谱柱型号为安捷伦PoroshellHPH-C18的2.1mm×100mm，2.7μm的液相色谱柱。4.根据权利要求1所述的KM的肝微粒体代谢分析，其特征在于：所述肝微粒体为人、小型猪、SD大鼠、恒河猴和比格犬的肝微粒体。5.一种KM的相关动物伴随毒代动力学研究，其特征在于：包括以下步骤：（1）染毒实验动...

【专利技术属性】
技术研发人员：林菁，俞昌喜，魏文增，黄慧玲，叶丽香，
申请(专利权)人：福建医科大学，
类型：发明
国别省市：福建,35