一种定量检测海参多糖的方法技术

本发明专利技术公开了一种定量检测海参多糖的方法，包括步骤：向三氟乙酸水溶液中加入硫酸软骨素及岩藻糖，配制标准样品溶液；提取待测海参或海参制品样品中的多糖；酸水解、除酸，加入氨水、内标物乳糖、衍生化；液相色谱‑质谱联用检测含有硫酸软骨素二糖衍生物、岩藻糖衍生物的各浓度标准样品溶液及待测样品溶液，得出待测样品中硫酸软骨素和岩藻糖的含量，进而得到待测样品中岩藻聚糖和岩藻糖基化硫酸软骨素的含量。本发明专利技术方法用于快速定量测定海参多糖，更准确，方便，且效率高，能够对不同种类、经过不同加工处理的海参多糖进行准确的定量测定，为不同的海参加工产品的质量控制提供了有效手段。

Method for quantitatively detecting sea cucumber polysaccharide

The invention discloses a method for quantitative detection of sea cucumber polysaccharide, which comprises the following steps: adding to chondroitin sulfate and fucose three trifluoroacetic acid aqueous solution, preparation of standard sample solution to be measured; extraction of polysaccharide samples of sea cucumber or sea cucumber products; acid hydrolysis, acid removing, adding ammonia derivatization and internal standard lactose the concentration of standard solution,; sample detection combined with liquid chromatography mass spectrometry containing chondroitin sulfate two sugar derivatives, fucose derivatives and the sample solution, the results show that the content of chondroitin and fucose in the sample to be measured, and then to obtain the determination of samples of fucoidan and fucosylated chondroitin sulfate. The invention relates to a method for the determination of sea cucumber polysaccharide, fast accurate, convenient, and high efficiency, capable of quantitative determination of different kinds and different after processing of sea cucumber polysaccharide were accurate, provides an effective method for quality control of different processed products of sea cucumber.

【技术实现步骤摘要】
一种定量检测海参多糖的方法
本专利技术涉及一种检测生物大分子的方法，更具体，涉及定量检测海参多糖的方法。
技术介绍
海参中营养物质种类和含量丰富，海参多糖在海参中的营养成分占重要地位。海参多糖(seacucumberpolysaccharide)的结构主要有两类：一类是海参糖胺聚糖，又称岩藻糖化硫酸软骨素，另一类是海参岩藻聚糖。虽然两类的糖基组成不同，但它们的糖链上都被不同程度的硫酸酯化。研究发现海参多糖对人体的生理功能调控、维系生命好的状态具有很重要的意义，主要表现在抵抗血栓、肿瘤、凝血和降低血清胆固醇以及提高身体免疫力等方面。目前社会对海参的需求也越来越多，海参加工产品多种多样，导致产品品质也各有不同。因此，定量检测海参多糖是相关加工工艺产品的质量控制的必要措施，也是对含这类多糖的食品质量评价的有力手段。目前，对这些海参多糖的定量检测，主要集中在对降解产生的不同单糖组分的检测分析，最为常用的是化学显色法。例如经过分离纯化后，通过咔唑法测定糖醛酸含量从而间接测定含糖醛酸多糖，以及通过Elson-Morgan法测定氨基糖含量。但这些化学显色法缺乏特异性，难以得到准确的结果。申请号200810016622.8的“一种海参及海参制品中海参多糖含量的测定方法”也作了相关报道，该方法通过酶解醇沉等步骤，以岩藻糖含量为基准，乘以转化系数得到了海参多糖的含量。但是，目前还缺乏同时对岩藻糖基化硫酸软骨素和岩藻多糖这两种多糖进行定量的检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于实现海参多糖的定量分析，使海参中的海参糖胺聚糖和海参岩藻聚糖能够同时、快速、准确的完成定量检测。为了达到上述目的，本专利技术提供了一种定量检测海参多糖的方法，包括如下步骤：S1、向1.3mol/L的三氟乙酸水溶液中加入硫酸软骨素及岩藻糖，配制一系列浓度梯度的含有硫酸软骨素及岩藻糖的标准样品溶液；所述硫酸软骨素及岩藻糖的浓度均在0.02～0.4mg/ml范围内；所述硫酸软骨素及岩藻糖最优浓度范围为0.04～0.2mg/ml；S2、提取待测样品中的多糖：将待测样品粉碎、混匀后，准确称量，然后采用酶解后醇沉法提取、冻干，得到待测样品海参多糖提取物，向所述待测样品海参多糖提取物中加入三氟乙酸水溶液，所述三氟乙酸水溶液的浓度为1.3mol/L，得到待测样品海参多糖溶液；所述待测样品为海参或海参制品；优选方式下，所述待测样品海参多糖溶液中每毫升三氟乙酸水溶液加入所述待测样品海参多糖提取物0.1～100mg；S3、准确量取步骤S1制得的各浓度标准溶液及步骤S2制得的待测样品溶液、密封，分别准确1.00ml标准溶液和待测样品溶液，密封，在105℃下水解3h，放置室温，采用冷冻离心浓缩除去溶剂，收集固相；向所述固相物质中加入0.3～1mL甲醇或水，再采用冷冻离心浓缩除去溶剂，重复三次，达到除酸目的，得到各浓度标准样品溶液及待测样品溶液的固相残余物；S4、向步骤S3制得的各样品溶液的固相残余物中分别加入等量的氨水溶解，再加入乳糖作为内标物，加入1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)进行衍生化，得到含有硫酸软骨素二糖衍生物、岩藻糖衍生物的各浓度标准样品溶液及待测样品溶液；S5、液相色谱-质谱联用检测步骤S4制得的含有硫酸软骨素二糖衍生物、岩藻糖衍生物的各浓度标准样品溶液及待测样品溶液，得到各样品中硫酸软骨素二糖衍生物和岩藻糖衍生物各自监测离子色谱峰面积；检测条件为：高效液相色谱-三重四极杆质谱仪；色谱条件为：反相色谱柱，柱温30℃，流动相20mmol乙酸铵-乙腈(88:12，V/V)，流速0.5mL/min；质谱条件：离子源ESI源，正离子模式检测，喷雾电压5.5kV，辅助加热气温度：600℃，氮气作为碰撞气和喷雾气，选择多重反应监测(MRM)，监测的离子对包括673.3/175.0、687.3/175.0、495.2/175.0；S6、根据色谱峰保留时间和监测特征离子对区分内标乳糖衍生物、标样多糖的硫酸软骨素二糖衍生物和岩藻糖衍生物，然后以标样色谱峰面积和内标样峰面积的比值作为响应值，根据响应值和标准糖浓度绘制工作曲线，对照工作曲线，得出待测样品中硫酸软骨素和岩藻糖的含量；S7、根据步骤S6得到的硫酸软骨素和岩藻糖的含量，结合公式(1)、(2)得到待测样品中岩藻聚糖和岩藻糖基化硫酸软骨素的含量；X＝mCS/A％(1)，Y＝mFuc×M(Fuc-H2O)/M(Fuc)－X×(1－A％)(2)，其中，X为岩藻糖基化硫酸软骨素的含量(mg/g)，Y为岩藻聚糖的含量(mg/g)，mCS为样品中硫酸软骨素的含量(mg/g)，mFuc为样品中岩藻糖的含量(mg/g)，A％为硫酸软骨素主链在岩藻糖基化硫酸软骨素所占比例。岩藻聚糖的结构组成为硫酸软骨素和岩藻糖；而岩藻聚糖是由岩藻糖所构成的直链多糖。A可以通过采用核磁共振氢谱分析纯化后的岩藻糖基化硫酸软骨素得到，也可以采用色谱方法分析纯化后岩藻糖基化硫酸软骨素的降解产物得到。优选方式下，步骤S4的具体操作为：将步骤S3制得的各样品溶液的固相残余物分别进行以下处理：将所述样品溶液的固相残余物全部加入到400μL的氨水中溶解，再加入1mg/ml的乳糖溶液100μL、0.3mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮甲醇溶液400μL，密封，70℃环境下反应30min；反应结束后，加入1mL甲醇或水，离心浓缩除去溶剂，重复三次；再加入1mL的体积浓度为1％乙酸水溶液、1mL氯仿萃取，震荡后静置，除去氯仿，收集水相，重复萃取三次后，取最终的水相作为样品供试液。本专利技术的有益效果是：1、本专利技术中通过检测降解产生的硫酸软骨素特征二糖片段和岩藻糖，能够实现同时检测海参中岩藻糖基化硫酸软骨素和岩藻多糖的含量。2、本专利技术方法用于快速定量测定海参多糖，更准确，方便，且效率高，能够对不同种类、经过不同加工处理的海参多糖进行准确的定量测定，为不同的海参加工产品的质量控制提供了有效手段。3、本专利技术采用离心浓缩方法除去样品中的三氟乙酸和氨水，适合批量处理样品，而且相对于氮吹、真空烘干等方法，样品不易发生损失，能够保证定量检测的准确可靠。4、本专利技术建立了适用于海参多糖检测的三重四极杆质谱检测方法，确定了监测离子对，保证了检测的稳定性和灵敏度。附图说明图1是实施例1的典型的混合标准糖溶液MRM色谱图图2是实施例1的典型的海参多糖样品溶液MRM色谱图具体实施方式下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本专利技术，但不以任何方式限制本专利技术。本专利技术提供一种内标法定量检测海参多糖的方法，具体步骤如下：S1、配制一系列浓度梯度的硫酸软骨素和岩藻糖标准品溶液，其中硫酸软骨素和岩藻糖浓度在0.02～0.4mg/ml范围内，其中最优浓度范围为0.04～0.2mg/ml；溶液为1.3mol/L的三氟乙酸的水溶液。S2、将样品混匀、粉碎后，采用酶解后醇沉法提取样品中的多糖，并加入三氟乙酸溶液，使待测溶液中三氟乙酸浓度为1.3mol/L。S3、准确量取1.00mL标准溶液和待测样品溶液，密封，105℃下水解3h，放置室温，采用冷冻离心浓缩除去溶剂，然后加入0.3～1mL甲醇或水，再采用冷冻离心浓缩除去溶剂，以上操作重复三次，达到除酸目的；S4、加入400μL的氨水溶解残本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种定量检测海参多糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、向1.3mol/L的三氟乙酸水溶液中加入硫酸软骨素及岩藻糖，配制一系列浓度梯度的含有硫酸软骨素及岩藻糖的标准样品溶液；所述硫酸软骨素及岩藻糖的浓度均在0.02～0.4mg/ml范围内；S2、提取待测样品中的多糖：将待测样品粉碎、混匀后，准确称量，然后采用酶解后醇沉法提取、冻干，得到待测样品海参多糖提取物，向所述待测样品海参多糖提取物中加入三氟乙酸水溶液，所述三氟乙酸水溶液的浓度为1.3mol/L，得到待测样品海参多糖溶液；所述待测样品为海参或海参制品；S3、准确量取步骤S1制得的各浓度标准溶液及步骤S2制得的待测样品溶液、密封，分别准确1.00ml标准溶液和待测样品溶液，密封，在105℃下水解3h，放置室温，采用冷冻离心浓缩除去溶剂，收集固相；向所述固相物质中加入0.3～1mL甲醇或水，再采用冷冻离心浓缩除去溶剂，重复三次，达到除酸目的，得到各浓度标准样品溶液及待测样品溶液的固相残余物；S4、向步骤S3制得的各样品溶液的固相残余物中分别加入等量的氨水溶解，再加入乳糖作为内标物，加入1‑苯基‑3‑甲基‑5‑吡唑啉酮进行衍生化，得到含有硫酸软骨素二糖衍生物、岩藻糖衍生物的各浓度标准样品溶液及待测样品溶液；S5、液相色谱‑质谱联用检测步骤S4制得的含有硫酸软骨素二糖衍生物、岩藻糖衍生物的各浓度标准样品溶液及待测样品溶液，得到各样品中硫酸软骨素二糖衍生物和岩藻糖衍生物各自监测离子色谱峰面积；检测条件为：高效液相色谱‑三重四极杆质谱仪；色谱条件为：反相色谱柱，柱温30℃，流动相20mmol乙酸铵‑乙腈(88:12，V/V)，流速0.5mL/min；质谱条件：离子源ESI源，正离子模式检测，喷雾电压5.5kV，辅助加热气温度：600℃，氮气作为碰撞气和喷雾气，选择多重反应监测(MRM)，监测的离子对包括673.3/175.0、687.3/175.0、495.2/175.0；S6、根据色谱峰保留时间和监测特征离子对区分内标乳糖衍生物、标样多糖的硫酸软骨素二糖衍生物和岩藻糖衍生物，然后以标样色谱峰面积和内标样峰面积的比值作为响应值，根据响应值和标准糖浓度绘制工作曲线，对照工作曲线，得出待测样品中硫酸软骨素和岩藻糖的含量；S7、根据步骤S6得到的硫酸软骨素和岩藻糖的含量，结合公式(1)、(2)得到待测样品中岩藻聚糖和岩藻糖基化硫酸软骨素的含量；X＝m...

【技术特征摘要】
1.一种定量检测海参多糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、向1.3mol/L的三氟乙酸水溶液中加入硫酸软骨素及岩藻糖，配制一系列浓度梯度的含有硫酸软骨素及岩藻糖的标准样品溶液；所述硫酸软骨素及岩藻糖的浓度均在0.02～0.4mg/ml范围内；S2、提取待测样品中的多糖：将待测样品粉碎、混匀后，准确称量，然后采用酶解后醇沉法提取、冻干，得到待测样品海参多糖提取物，向所述待测样品海参多糖提取物中加入三氟乙酸水溶液，所述三氟乙酸水溶液的浓度为1.3mol/L，得到待测样品海参多糖溶液；所述待测样品为海参或海参制品；S3、准确量取步骤S1制得的各浓度标准溶液及步骤S2制得的待测样品溶液、密封，分别准确1.00ml标准溶液和待测样品溶液，密封，在105℃下水解3h，放置室温，采用冷冻离心浓缩除去溶剂，收集固相；向所述固相物质中加入0.3～1mL甲醇或水，再采用冷冻离心浓缩除去溶剂，重复三次，达到除酸目的，得到各浓度标准样品溶液及待测样品溶液的固相残余物；S4、向步骤S3制得的各样品溶液的固相残余物中分别加入等量的氨水溶解，再加入乳糖作为内标物，加入1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮进行衍生化，得到含有硫酸软骨素二糖衍生物、岩藻糖衍生物的各浓度标准样品溶液及待测样品溶液；S5、液相色谱-质谱联用检测步骤S4制得的含有硫酸软骨素二糖衍生物、岩藻糖衍生物的各浓度标准样品溶液及待测样品溶液，得到各样品中硫酸软骨素二糖衍生物和岩藻糖衍生物各自监测离子色谱峰面积；检测条件为：高效液相色谱-三重四极杆质谱仪；色谱条件为：反相色谱柱，柱温30℃，流动相20mmol乙酸铵-乙腈(88:12，V/V)，流速0.5mL/min；质谱条件：离子源ESI源，正离子模式检测，喷雾电压5.5kV，辅助加热气温度：600℃，氮气作为碰撞气和喷雾气，选择多重反应监测(MRM)，监测的离子对包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋爽，鲁姣姣，艾春青，温成荣，郭丽，张豹，徐鑫，武苏凤，
申请(专利权)人：大连工业大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21