一种青霉素检测方法技术

本发明专利技术公开了一种青霉素检测方法，包括如下步骤：配制细菌内毒素检测用分散液：取甘油、阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂，溶于注射用水或细菌内毒素检查用水中，调pH至6～8，去内毒素，得分散液，其中，甘油浓度为0.1～2%（v/v），阴离子表面活性剂浓度为0.05～0.5%（w/v），非离子表面活性剂浓度为0.1～1%（v/v）。本发明专利技术灵敏度高，可满足我国对于青霉素在动物性组织中的最高残留限量的检测要求，可为青霉素菌渣资源化利用为饲料提供一定的技术依据。

Method for detecting penicillin

The invention discloses a method for detecting penicillin, which comprises the following steps: preparation of bacterial endotoxin test for dispersion: glycerol, anionic surfactant and nonionic surfactant, dissolved in water for injection or bacterial endotoxin with water, adjusting pH to 6 ~ 8, go to the internal toxin, dispersion solution, the the concentration of glycerol was 0.1 ~ 2% (v/v), anionic surfactant concentration is 0.05 ~ 0.5% (w/v), nonionic surfactant concentration is 0.1 ~ 1% (v/v). The invention has high sensitivity and can satisfy the detection requirements of the highest residue limit of penicillin in animal tissues in China, and can provide a certain technical basis for the utilization of penicillin residue and feed for the feed.

【技术实现步骤摘要】
一种青霉素检测方法
本专利技术涉及一种检测方法，具体是一种青霉素检测方法。
技术介绍
抗生素作为一种主要的代表性兽药，在食品安全及世界贸易迅速发展的今天，受到了广泛的关注，目前对其检测仍然主要集中在动物源性食品中，主要的检测方法有高效液相色谱法，高效液相色谱-串联质谱法，毛细管电泳法，酶联免疫法。抗生素菌渣是抗生素生产企业在生产过程中的废弃物，底物主要由大豆、花生饼、玉米蛋白、淀粉等组成，外观呈豆腐渣样，气味因培养的菌类不同而异；内部含粗蛋白、脂肪、糖份等营养成分以及水和少量的抗生素残留成份，当环境温度在15～20℃时24小时、25～0℃时3小时会变臭液化，遇水、雨、雪、雾或蒸汽时会加速液化变质。一般每100m³的发酵液可形成约30～40m³的湿菌渣，据有关资料统计，我国年排放量约为100万吨以上。由于药渣黏度大，不能排入下水道，只能占用土地堆放。如果这些药渣不能被无害化处置利用，不仅会浪费大量资源，而且会污染生态环境。过去一直对菌渣采用干燥加工处理后作为饲料或饲料添加剂使用。但是，目前研究结果发现，药渣中的微量抗生素容易在被饲喂的畜禽体内残留，长期食用这种含有药物残留的动物源性食品，会对人类肝脏造成损伤。章明奎等人对抗生素诱导土壤可培养细菌产生耐药性进行了研究。抗生素在菌丝体残留量的检测在国外研究尚早，主要的检测方法是高效液相色谱法，1994年，L.H.Christensen等人所建立的青霉素发酵过程中中间产物的高效液相色谱法作为一种经典的检测方法被广泛使用，C18柱子被用来进行分离，乙腈与磷酸盐缓冲液的混合溶液作为流动相，之后也有一些文献报道了青霉素G及其降解产物的高效液相色谱法。但这些方法的灵敏度均较低，不能满足现代残留检测分析的要求。目前在国内文献中鲜少提到菌渣中抗生素的残留检测方法，且方法较不完善，并没有明确的方法检出限及回收率实验，不具有明显的可靠性，因此尚需要进一步研究，其中，刘慧娟等人在青霉素酶在青霉素菌渣无害化处理中的应用中采用高效液相色谱法进行了研究，此外，微生物法在菌渣中抗生素残留的检测也有应用，但本方法不具有一定的专一性，所测抗生素可能含有其降解产物。因此，准确可靠的残留检测方法还有待探讨。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种青霉素检测方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种青霉素检测方法，包括如下步骤：（1）配制细菌内毒素检测用分散液：取甘油、阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂，溶于注射用水或细菌内毒素检查用水中，调pH至6～8，去内毒素，得分散液，其中，甘油浓度为0.1～2%（v/v），阴离子表面活性剂浓度为0.05～0.5%（w/v），非离子表面活性剂浓度为0.1～1%（v/v）；（2）绘制标准曲线，拟合标准曲线方程：青霉素标准品溶解于溶剂中，并利用溶剂稀释配制成浓度在0.1μg·mML-1～2000μg·mML-1之间不同梯度浓度的青霉素标准溶液，然后采用0.45μm针头过滤器过滤，利用高效液相色谱法进行检测，以色谱峰面积为纵坐标、以青霉素标准溶液浓度为横坐标将高效液相色谱法检测绘制成标准曲线，然后进行拟合，得到标准曲线方程：Y=kX+b，方程中Y表示色谱峰面积，X表示青霉素的浓度，k和b为常数；所述的溶剂由乙腈和水按乙腈与水的体积比为1:1混合而成；（3）提取：首先将青霉素菌渣加入提取液中，混合均匀后超声提取25min～35min，然后进行离心分离，离心分离得到的上清液即为青霉素粗提液，向青霉素粗提液中加入无水硫酸钠和正己烷，再次进行离心分离，离心分离后分三层，取中间层，即为青霉素提取液；所述的青霉素菌渣的质量与提取液的体积比为1g:(3mL～5mL)；所述的提取液由乙腈和质量分数为0.3%的甲酸水溶液按乙腈与质量分数为0.3%的甲酸水溶液的体积比为3:1混合而成；所述的无水硫酸钠与青霉素菌渣的质量比为(0.8～1.2):1；所述的正己烷的体积与青霉素菌渣的质量比为(0.8mL～1.2mL):1g；（4）活化处理：首先采用5.0mL甲醇过WatersOasis-C18固相萃取小柱，然后采用5.0mL蒸馏水过WatersOasis-C18固相萃取小柱，即完成WatersOasis-C18固相萃取小柱活化处理；（5）洗脱：在过柱流速为1.0mL·min-1～3.0mL·min-1和真空条件下将步骤二得到的青霉素提取液过步骤三得到的活化处理后WatersOasis-C18固相萃取小柱，然后采用质量分数为5%的甲醇水溶液淋洗，再采用洗脱液进行洗脱，洗脱得到的液体在水浴温度为24℃～26℃下N2吹干，然后加入复溶溶剂溶解N2吹干得到的固体，然后采用0.45μm针头过滤器过滤，得到待检测液；所述的洗脱液的体积与步骤二中所述的青霉素菌渣的质量比为(0.6mL～1.0mL):1g；所述的洗脱液由乙腈和甲醇按乙腈与甲醇的体积比为3:1混合而成；所述的复溶溶剂的体积与步骤二中所述的青霉素菌渣的质量比为0.2mL:1g；所述的复溶溶剂由乙腈和水按乙腈与水的体积比为1:1混合而成。作为本专利技术进一步的方案：所述阴离子表面活性剂HLB值为2～13。作为本专利技术再进一步的方案：所述阴离子表面活性剂的HLB值为14～18。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术灵敏度高，可满足我国对于青霉素在动物性组织中的最高残留限量的检测要求，可为青霉素菌渣资源化利用为饲料提供一定的技术依据。具体实施方式下面对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。本专利技术实施例中，一种青霉素检测方法，包括如下步骤：（1）配制细菌内毒素检测用分散液：取甘油、阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂，溶于注射用水或细菌内毒素检查用水中，调pH至6～8，去内毒素，得分散液，其中，甘油浓度为0.1～2%（v/v），阴离子表面活性剂浓度为0.05～0.5%（w/v），非离子表面活性剂浓度为0.1～1%（v/v）；（2）绘制标准曲线，拟合标准曲线方程：青霉素标准品溶解于溶剂中，并利用溶剂稀释配制成浓度在0.1μg·mML-1～2000μg·mML-1之间不同梯度浓度的青霉素标准溶液，然后采用0.45μm针头过滤器过滤，利用高效液相色谱法进行检测，以色谱峰面积为纵坐标、以青霉素标准溶液浓度为横坐标将高效液相色谱法检测绘制成标准曲线，然后进行拟合，得到标准曲线方程：Y=kX+b，方程中Y表示色谱峰面积，X表示青霉素的浓度，k和b为常数；所述的溶剂由乙腈和水按乙腈与水的体积比为1:1混合而成；（3）提取：首先将青霉素菌渣加入提取液中，混合均匀后超声提取25min～35min，然后进行离心分离，离心分离得到的上清液即为青霉素粗提液，向青霉素粗提液中加入无水硫酸钠和正己烷，再次进行离心分离，离心分离后分三层，取中间层，即为青霉素提取液；所述的青霉素菌渣的质量与提取液的体积比为1g:(3mL～5mL)；所述的提取液由乙腈和质量分数为0.3%的甲酸水溶液按乙腈与质量分数为0.3%的甲酸水溶液的体积比为3:1混合而成；所述的无水硫酸钠与青霉素菌渣的质量比为(0.8～1.2):1；所述的正己烷的体积与青霉素菌渣的质量比为(0.8mL～1.2mL):1g；（4）活化处理：首先采用5.0mL甲醇过WatersO本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种青霉素检测方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）配制细菌内毒素检测用分散液：取甘油、阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂，溶于注射用水或细菌内毒素检查用水中，调pH至6～8，去内毒素，得分散液，其中，甘油浓度为0.1～2%（v/v），阴离子表面活性剂浓度为0.05～0.5%（w/v），非离子表面活性剂浓度为0.1～1%（v/v）；（2）绘制标准曲线，拟合标准曲线方程 ：青霉素标准品溶解于溶剂中，并利用溶剂稀释配制成浓度在0.1μg·m～2000μg·mL

【技术特征摘要】
1.一种青霉素检测方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）配制细菌内毒素检测用分散液：取甘油、阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂，溶于注射用水或细菌内毒素检查用水中，调pH至6～8，去内毒素，得分散液，其中，甘油浓度为0.1～2%（v/v），阴离子表面活性剂浓度为0.05～0.5%（w/v），非离子表面活性剂浓度为0.1～1%（v/v）；（2）绘制标准曲线，拟合标准曲线方程：青霉素标准品溶解于溶剂中，并利用溶剂稀释配制成浓度在0.1μg·m～2000μg·mL-1之间不同梯度浓度的青霉素标准溶液，然后采用0.45μm针头过滤器过滤，利用高效液相色谱法进行检测，以色谱峰面积为纵坐标、以青霉素标准溶液浓度为横坐标将高效液相色谱法检测绘制成标准曲线，然后进行拟合，得到标准曲线方程：Y=kX+b，方程中Y表示色谱峰面积，X表示青霉素的浓度，k和b为常数；所述的溶剂由乙腈和水按乙腈与水的体积比为1:1混合而成；（3）提取：首先将青霉素菌渣加入提取液中，混合均匀后超声提取25min～35min，然后进行离心分离，离心分离得到的上清液即为青霉素粗提液，向青霉素粗提液中加入无水硫酸钠和正己烷，再次进行离心分离，离心分离后分三层，取中间层，即为青霉素提取液；所述的青霉素菌渣的质量与提取液的体积比为1g:(3mL～5mL)；所述的提取液由乙腈和质量分数为0.3%的甲酸水溶液按乙腈与质量分数为0.3%的甲酸水溶液的体积比...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨敏，周合，张根义，张进，周朱晨，胡彬，吴念绮，
申请(专利权)人：百奥森江苏食品安全科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32