检测巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变的巢式PCR引物及方法技术

本发明专利技术涉及病毒基因突变检测技术领域，具体涉及检测巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变的巢式PCR引物及方法。该引物包括五对引物，对于UL54基因，第一轮PCR扩增引物为第一对引物，第二轮PCR扩增引物为第二和第三对引物，各引物序列如SEQ ID No.1‑6所示。对于UL97基因，第一轮PCR扩增引物为第四对引物，第二轮PCR扩增引物为第五对引物，各引物序列如SEQ ID No.7‑10 所示。选用本发明专利技术的巢式PCR引物，采用巢式PCR方法，优化PCR反应体系和反应程序，扩增UL54和UL97基因具有高敏感性和高度扩增特异性，可用于分析其耐药基因突变，实用性强，符合临床推广的要求。

Nested PCR primer and method for detecting drug-resistant mutation of cytomegalovirus UL54 and UL97 gene

The invention relates to the technical field of virus gene mutation detection, in particular to a nested PCR primer and a method for detecting the mutation of CMV UL54 and UL97 gene resistance. The primers including five pairs of primers for UL54 gene, the first round of the first PCR primers as primers, second primers and third pairs of the second round of the PCR, the primer sequences such as SEQ ID No.1 6 shows. For the first round of the PCR UL97 gene, fourth pairs of primers for PCR amplification primers for the second round, fifth pairs of primers, each primer sequence is shown as SEQ ID No.7 10. The nested PCR primers were selected according to the present invention, using nested PCR methods and optimization of PCR reaction system and reaction program, amplification of UL54 gene and UL97 gene with Gao Min emotional and highly amplification specificity for the drug resistance gene mutation analysis, strong practicability, meet the clinical requirements.

【技术实现步骤摘要】
检测巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变的巢式PCR引物及方法
本专利技术涉及病毒基因突变检测
，具体涉及检测巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变的巢式PCR引物及方法。
技术介绍
HCMV属于疱疹病毒科,β疱疹病毒亚科,巨细胞病毒属,人疱疹病毒5型。HCMV基因组为线性双股DNA分子,长约230kb,由长单一序列(UL)和短单一序列(US)构成。HCMV在自然界广泛存在,正常人群中自然感染普遍。人巨细胞病毒（HCMV）是一种免疫缺陷或免疫不成熟人群的条件致病菌，大多数感染者无明显症状,但在先天感染的儿童中，或免疫功能受抑制的个体，如器官移植者，获得性免疫缺陷病综合征（艾滋病）患者中，容易激活感染，引发严重病变，危及生命。此外，巨细胞病毒宫内感染还是导致出生缺陷的主要原因之一。因此，巨细胞病毒的药物干预和治疗显得尤为重要。治疗HCMV感染的抗病毒药物为更昔洛韦（GCV），西多福韦（CDV）和膦甲酸（PFA）。巨细胞病毒耐药突变主要是由于UL97和UL54基因发生突变导致。UL97基因全长2124个碱基,编码一种蛋白激酶相关的磷酸转移酶，含有保守的丝氨酸/苏氨酸激酶功能域。HCMV感染细胞内的磷酸化过程是UL97基因编码的产物所完成。GCV是第一个被开发及应用最普遍的治疗HCMV感染的高效药物,必须在此酶作用下发生单磷酸化进一步三磷酸化发挥抗病毒作用,因此，UL97基因的突变导致GCV不能发生磷酸化而获得活性,导致GCV耐药性的出现。GCV是目前预防和治疗HCMV病的一线药物，长期治疗后，GCV首先可发生UL97突变，因此UL97通常是临床检测耐药基因突变的首选基因。GCV耐药突变主要集中在460、520、590至607位点（图1），如M460V/I,H520Q,C592G,A594V,L595S和C603W出现在80%以上以GCV为首选药物的病人体内。UL54基因全长3729个碱基,编码由1242个氨基酸组成的DNA聚合酶。与UL97基因突变只能导致更昔洛韦（GCV）耐药不同，因为三种药物都是针对编码病毒DNA聚合酶的UL54基因的，因此该基因的突变可以导致这三种药物耐药。与UL97基因耐药位点较为集中不同，UL54基因突变位点更多，其耐药检测只能通过测序，至少需覆盖氨基酸300-1000位点（图1）。抗HCMV药物耐药是免疫功能缺陷患者的一个严重的问题，UL54和UL97基因突变引起的多药物耐药对于异源干细胞移植病人可危及生命。目前，传统基因突变诊断方法包括限制性片段长度多态性分析（RFLP），基因芯片法，荧光定量PCR等，这些方法存在耗时费力或所需设备和耗材昂贵等缺点，导致不能在临床大规模推广，应用受到限制。同时，巨细胞病毒（HCMV）UL54和UL97基因耐药突变位点众多，上述方法根本无法全部涵盖这些位点。因此有必要建立一种高效率、使用方便的巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变的方法，以实现临床快速检测和大规模人群筛查。用本专利申请的巢式PCR的方法进行检测可以完全覆盖所有的突变位点，且不需要贵重的专用仪器，对技术人员要求不高，只需要PCR实验室常规的设备即可，适用于在国内医院推广使用。
技术实现思路
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本专利技术的目的在于提供一种检测巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变的巢式PCR引物，该巢式PCR引物可以高特异、高灵敏度和高效的检测巨细胞病毒UL54和UL97基因。本专利技术的另一目的在于提供一种检测巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变的巢式PCR方法，该巢式PCR方法具有高度的特异性、灵敏度与准确性，所得到的PCR产物可直接送去测序，根据序列即可分析巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变情况。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种检测巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变的巢式PCR引物，该巢式PCR引物包括第一轮PCR扩增引物和第二轮PCR扩增引物（图2）：当检测巨细胞病毒UL54时，第一轮PCR扩增引物为：第一对引物：正向引物UL54-SF1和反向引物UL54-SR1；第二轮PCR扩增引物为第二对引物和第三对引物：第二对引物：正向引物UL54-SF2和反向引物UL54-SR2；第三对引物：正向引物UL54-SF3和反向引物UL54-SR3；当检测巨细胞病毒UL97时，所述第一轮PCR扩增引物为：第四对引物：正向引物UL97-SF1和反向引物UL97-SR1；所述第二轮PCR扩增引物为：第五对引物：正向引物UL97-SF2和反向引物UL97-SR2；其中，UL54-SF1基因序列如SEQIDNo.1所示，UL54-SR1基因序列如SEQIDNo.2所示，UL54-SF2基因序列如SEQIDNo.3所示，UL54-SR2如SEQIDNo.4所示，UL54-SF3基因序列如SEQIDNo.5所示，UL54-SR3如SEQIDNo.6所示，UL97-SF1如SEQIDNo.7所示，UL97-SF1如SEQIDNo.8所示，UL97-SF2如SEQIDNo.9所示，UL97-SR2如SEQIDNo.10所示。本专利技术提供的用于检测巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变的引物，第一到第三对引物用来扩增UL54基因，第四到第五对引物用来扩增UL97基因。第一对引物中的正向引物（即上游引物）UL54-SF1选择巨细胞病毒UL54基因nt731-747保守区域；反向引物(即下游引物)UL54-SR1主要部分选择nt3223-3239保守区域。第一对引物将扩增出2509bp大小的片段。第二对引物中的正向引物UL54-SF2选择巨细胞病毒UL54基因nt779-796位保守区域；反向引物UL54-SR2选择nt1924-1940位保守区域。第二对引物将扩增出1162bp大小的片段。第三对引物中的正向引物UL54-SF3选择巨细胞病毒UL54基因nt1795-1818位保守区域；反向引物UL54-SR3选择nt3033-3048位保守区域。第三对引物将扩增出1254bp大小的片段。第四对引物中的正向引物UL97-SF1选择巨细胞病毒UL97基因nt821-842位保守区域，第四对引物中的反向引物UL97-SR1选择巨细胞病毒UL97基因nt1953-1972位保守区域，第四对引物将扩增出1152bp大小的片段。第五对引物中的正向引物UL97-SF2选择巨细胞病毒UL97基因nt868-886位保守区域，第五对引物中的反向引物UL97-SR2选择巨细胞病毒UL97基因nt1914-1933位保守区域，第五对引物将扩增出1066bp大小的片段。本专利技术的另一目的通过下述技术方案实现：一种采用上述所述的巢式PCR引物检测巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变的巢式PCR方法，其包括如下步骤：（1）以第一轮PCR扩增引物对待检测DNA进行第一轮PCR，得到第一轮PCR产物，进行50-150倍稀释，得到第一轮PCR稀释产物；（2）以第二轮PCR扩增引物对第一轮PCR稀释产物进行第二轮PCR，得到第二轮PCR产物；（3）对第二轮PCR产物进行检测。优选地，所述步骤（1）中，待检测DNA是从待检血清或血浆中提取DNA而得。优选地，所述步骤（1）中，第一轮PCR反本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变的巢式PCR引物，其特征在于：该巢式PCR引物包括第一轮PCR扩增引物和第二轮PCR扩增引物：当检测巨细胞病毒UL54时，第一轮PCR扩增引物为：第一对引物：正向引物UL54‑SF1和反向引物UL54‑SR1；第二轮PCR扩增引物为第二对引物和第三对引物：第二对引物：正向引物UL54‑SF2和反向引物UL54‑SR2；第三对引物：正向引物UL54‑SF3和反向引物UL54‑SR3；当检测巨细胞病毒UL97时，第一轮PCR扩增引物为：第四对引物：正向引物UL97‑SF1和反向引物UL97‑SR1；第二轮PCR扩增引物为：第五对引物：正向引物UL97‑SF2和反向引物UL97‑SR2；其中，UL54‑SF1基因序列如SEQ ID No.1 所示，UL54‑SR1基因序列如SEQ ID No.2所示，UL54‑SF2基因序列如SEQ ID No.3 所示，UL54‑SR2如SEQ ID No.4 所示，UL54‑SF3基因序列如SEQ ID No.5所示，UL54‑SR3如SEQ ID No.6 所示，UL97‑SF1如 SEQ ID No.7 所示，UL97‑SF1如 SEQ ID No.8 所示，UL97‑SF2如SEQ ID No.9 所示，UL97‑SR2如SEQ ID No.10 所示。...

【技术特征摘要】
1.一种检测巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变的巢式PCR引物，其特征在于：该巢式PCR引物包括第一轮PCR扩增引物和第二轮PCR扩增引物：当检测巨细胞病毒UL54时，第一轮PCR扩增引物为：第一对引物：正向引物UL54-SF1和反向引物UL54-SR1；第二轮PCR扩增引物为第二对引物和第三对引物：第二对引物：正向引物UL54-SF2和反向引物UL54-SR2；第三对引物：正向引物UL54-SF3和反向引物UL54-SR3；当检测巨细胞病毒UL97时，第一轮PCR扩增引物为：第四对引物：正向引物UL97-SF1和反向引物UL97-SR1；第二轮PCR扩增引物为：第五对引物：正向引物UL97-SF2和反向引物UL97-SR2；其中，UL54-SF1基因序列如SEQIDNo.1所示，UL54-SR1基因序列如SEQIDNo.2所示，UL54-SF2基因序列如SEQIDNo.3所示，UL54-SR2如SEQIDNo.4所示，UL54-SF3基因序列如SEQIDNo.5所示，UL54-SR3如SEQIDNo.6所示，UL97-SF1如SEQIDNo.7所示，UL97-SF1如SEQIDNo.8所示，UL97-SF2如SEQIDNo.9所示，UL97-SR2如SEQIDNo.10所示。2.一种利用权利要求1所述的巢式PCR引物检测巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变的巢式PCR方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）以第一轮PCR扩增引物对待检测DNA进行第一轮PCR，得到第一轮PCR产物，进行稀释后得到第一轮PCR稀释产物；（2）以第二轮PCR扩增引物对第一轮PCR稀释产物进行第二轮PCR，得到第二轮PCR产物；（3）对第二轮PCR产物进行检测。3.根据权利要求2所述的检测巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变的巢式PCR方法，其特征在于：所述步骤（1）中，待检测DNA是从待检血清或血浆中提取DNA而得。4.根据权利要求2所述的检测巨细...

【专利技术属性】
技术研发人员：黎四平，马强，陆小梅，钟柏茂，谢明玉，彭琪，饶春宝，
申请(专利权)人：东莞市第八人民医院东莞市儿童医院，东莞市儿科研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44